金花葵花总黄酮对衰老模型小鼠抗氧化和免疫功能的影响

吴正平

(宜春学院美容医学院，江西 宜春 336000)

金花葵(Hibiscus manihot L)，又名菜芙蓉，为锦葵科秋葵属1年生草本植物，是濒于灭绝的珍稀植物。花具有食用、药用、保健等功能，有较高的利用价值，主要活性成分为生物黄酮〔1〕。本研究采用D-半乳糖腹腔注射昆明种小鼠建立亚急性衰老模型，观察金花葵花总黄酮对其抗氧化和免疫功能的影响，以探讨金花葵花总黄酮延缓衰老的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与分组 实验选用昆明种健康小鼠40只(南昌大学实验动物科学部提供，合格证号:赣医动字第02196-02)，体重20～25 g，雄性，随机分为4组:正常对照组，亚急性衰老模型组，金花葵花总黄酮低剂量和高剂量给药组。

1.1.2 药品制备 取宜春市渥江乡种植的金花葵干花，粉碎，过2号筛，按单因素试验和正交试验优化了的金花葵花总黄酮提取工艺:液料比15∶1、温度75℃、乙醇浓度75%、时间2.5 h，提取液放凉，滤过，滤液回收乙醇至生药与浓缩液体积比约为1∶1，将浓缩液通过聚酰胺柱，加水30倍量(洗脱用水体积∶聚酰胺用量)洗脱，弃去洗脱液，再加30%乙醇洗脱，至洗脱液的三氯化铝反应为阳性，弃去洗脱液，加氨试液洗脱，收集洗脱液，至洗脱液的三氯化铝反应为阴性，将氨试液洗脱液合并，减压浓缩，真空干燥，即得金花葵花总黄酮提取物。三氯化铝法测定提取物中总黄酮的含量为45.40%。

1.1.3 试剂 D-半乳糖、人刀豆素A(ConA)、脂多糖(LPS)、噻唑篮(MTT)均为Sigma公司产品;超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品。

1.1.4 主要仪器 酶标仪(美国伯乐，型号:680型);紫外-可见分光光度计(日本岛津，型号:UA-240)。

1.2 方法

1.2.1 造模 取亚急性衰老模型组和金花葵花总黄酮低、高剂量给药组小鼠，颈背部皮下注射D-半乳糖120 mg/kg，正常组颈背部皮下注射生理盐水，1次/d，连续42 d。

1.2.2 给药 金花葵花总黄酮给药组小鼠在注射D-半乳糖期间灌胃(ig)金花葵花总黄酮:低剂量给药组40 mg/kg;高剂量给药组80 mg/kg，1次/d。正常组与模型组予以生理盐水。

1.2.3 血清SOD、MDA及GSH-Px测定 各组小鼠于第42天末次给药2 h后，称质量，眼球后静脉丛毛细管取血，静置后3 500 r/min离心10 min，取血清备用。分别严格按试剂盒操作程序测定。

1.2.4 胸腺、脾指数测定 无菌条件下剖取上述实验中小鼠的胸腺和脾，用生理盐水洗去血迹，剪去脂肪及筋膜组织，用滤纸吸干，称质量，计算胸腺指数和脾指数。胸腺指数=胸腺质量(mg)/体质量(g);脾指数=脾质量(mg)/体质量(g)。

1.2.5 MTT法淋巴细胞增殖试验 将上述脾脏无菌操作制备成脾细胞悬液，调整细胞浓度为3×109/L，取40孔细胞培养板，每孔加脾细胞0.2 ml，ConA(T淋巴细胞增殖反应)15μl(终浓度为6 mg/L)或LPS(B淋巴细胞增殖反应)20μl(终浓度为50 mg/L)，一个样品加3个重复孔，培养板加盖置于37℃，5%CO2培养箱中培养72 h。酶标仪于570 nm波长处读取光密度值(OD)，并计算刺激指数SI，SI=实验孔OD值/对照孔OD值。

1.3 统计学处理 应用SPSS11.5软件进行数据分析，实验结果以x±s表示，多组间样本均数比较采用方差分析。

2 结果

2.1 小鼠状态 正常组小鼠精神好，行动敏捷;毛发光泽、顺滑。模型组小鼠精神萎靡、嗜卧、行动迟缓;食欲明显下降;毛色干枯无光泽。金花葵花总黄酮给药组小鼠上述表现与模型组比较有良性逆转。

2.2 金花葵花总黄酮对小鼠血清MDA、SOD和GSH-Px的影响 与正常组比较，模型组血清MDA水平显著升高(P＜0.01)，SOD和GSH-Px水平显著降低(P＜0.01);与给药组比较，模型组血清MDA水平显著降低(P＜0.01)，SOD和GSH-Px水平明显升高(P＜0.05或P＜0.01)。见表1。

表1 金花葵花总黄酮对小鼠血清MDA、SOD和GSH-Px的影响(x ± s，n=10)

2.3 金花葵花总黄酮对小鼠胸腺、脾指数的影响 与正常组比较，模型组胸腺指数和脾指数均显著降低(P＜0.01)。给药组可使衰老小鼠胸腺指数和脾指数升高(P＜0.05)。见表2。

2.4 金花葵花总黄酮对小鼠淋巴细胞增殖的影响 与正常组比较，模型组脾 T、B淋巴细胞刺激指数均显著降低(P＜0.01);与给药组比较，模型组脾T、B淋巴细胞刺激指数均明显升高(P＜0.05)。见表3。

表2 金花葵花总黄酮对衰老小鼠胸腺指数和脾指数的影响(x ± s，n=10)

表3 金花葵花总黄酮对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响(x ± s，n=10)

3 讨论

人体衰老机制极为复杂，在现代医学众多衰老的学说中，衰老的免疫学理论占有重要地位〔2，3〕。衰老的免疫学理论认为，免疫系统从根本上参与了正常脊椎动物衰老过程，是衰老过程的主要调节系统之一，随着年龄的增长，免疫器官老化，免疫细胞及细胞因子发生改变，机体的免疫功能逐渐减弱，从而引起脾、胸腺指数等免疫指标下降。衰老的自由基理论由Harman提出〔4〕，受到现代医学研究者的普遍认同。衰老的自由基理论认为，随着年龄的增加，体内自由基的产生与消除失去平衡，过多自由基的产生可引起不同程度的细胞毒及瞬时的不可逆损伤，最终引起机体衰老。SOD是组织细胞内主要的抗氧化酶，能催化氧自由基发生歧化反应，使其进一步生成H2O2，而GSH-Px则能使H2O2迅速清除，这样两者共同作用能有效地阻止组织细胞受过氧化的损伤。但随着年龄的增长，机体内的SOD和GSH-Px活性逐渐减低。而机体内氧自由基可诱发生物膜不饱和脂肪酸-花生四烯酸过氧化，生成MDA等脂质过氧化物的代谢物，因此MDA是衡量机体内自由基代谢的敏感指标，客观反映体内自由基的水平。

本研究结果表明，金花葵花总黄酮可对D-半乳糖所致亚急性衰老小鼠的脾、胸腺指数，脾T、B淋巴细胞刺激指数，血清MDA、SOD、GSH-Px等多项指标施加影响，明显提高其脾、胸腺指数及T、B淋巴细胞增殖能力，降低血清MDA含量并使SOD、GSH-Px水平升高，从增强衰老小鼠抗氧化和免疫功能的角度证明了金花葵花总黄酮延缓衰老的作用。

1 仇 燕．菜芙蓉花中总黄酮微波提取的研究〔J〕．中药材，2006;29(4):387-90.

2 史进方，顾国浩，张学光.免疫衰老及其免疫学预警指标〔J〕.现代免疫学，2005;25(4):347-9.

3 Brink TC，Regenbrecht C，Demetrius L，et al.Activation of the immune response is a key feature of aging in mice〔J〕.Biogerontology，2009;10(6):721-34.

4 Bokov A，Chaudhuri A，Richardson A．The role of oxidative damage and stress in aging〔J〕．Mech Aging Dev，2004;125(10-11):811-26.