免疫亲和柱净化光化学衍生高效液相色谱-荧光检测法测定动物类药材中黄曲霉毒素＊

杨小丽 ，韦日伟 ，申红红 ，杨美华 ，欧阳臻

(1.中国医学科学院药用植物研究所，北京 100193; 2.江苏大学药学院，江苏 镇江 212013;3.广西中医学院，广西 南宁 530001)

黄曲霉毒素(AF)主要是由真菌黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)产生的毒性次生代谢产物，是一类具有强荧光性质的致癌、致畸的有毒物质，目前已确定的有黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2，M1，M2等 17 种[1]。由于黄曲霉毒素对人类身体健康的危害严重，许多国家、地区、国际组织已对其在食品中的限量标准作出了规定。近几年来，欧盟加强了对黄曲霉毒素的控制，并实施国际上最严格的限量标准，规定在花生、干果、坚果以及谷类(包括荞麦)中黄曲霉毒素B1限量为2 μg/kg，黄曲霉毒素总量(B1+B2+G1+G2)不得超过4 μg/kg[2]。动物药是指动物的整体或动物体的某一部分、动物体的生理或病理产物、动物体的加工品等供药用的一类中药，如果药材加工、贮藏、运输不当，很容易发生霉变，受黄曲霉毒素污染[3]。黄曲霉毒素的检测最初以薄层层析法为主，发展到现在已有高效液相色谱法、微柱法、超光谱法、化学免疫法等多种方法[4－6]。2010年版《中国药典(一部)》规定柱后碘衍生高效液相色谱－荧光法对桃仁、胖大海、陈皮、僵蚕等几味中药材中的黄曲霉毒素进行测定，其黄曲霉毒素B1的限量为5 μg/kg，黄曲霉毒素(B1+B2+G1+G2)的限量为10 μg/kg[7]。笔者首次采用免疫亲和柱净化、光化学衍生后高效液相色谱－荧光法测定动物药材中黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的含量，为动物类药材中黄曲霉毒素限量标准的制订提供参考。

1 仪器与试药

LC－20 AT型高效液相色谱仪，RF－10AXL型荧光检测器(日本岛津公司);Aura Industries型光化学衍生器;ZD－9556型水平摇床(太仓市科教器材厂);Afla－P黄曲霉毒素免疫亲和柱(美国Vicam公司);1.5 μm 玻璃纤维滤纸。黄曲霉毒素 B1，B2，G1，G2混合对照品溶液(美国 Suplco公司)，质量浓度分别为 1.0，0.3，1.0，0.3μg/mL);甲醇为色谱纯;动物药材均购于北京宏生堂药店。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱∶ProntosilKromaplus型100－5－C18柱(250mm×4.6mm，5 μm);流动相∶甲醇 － 水 (45:55);流速∶1 mL/min;进样量∶25 μL;柱温∶25℃;检测器∶荧光检测器，激发波长 360 nm，发射波长440 nm。

2.2 样品制备

准确称取12.5 g粉碎的待测样品，加入2.5 g氯化钠和50 mL甲醇－水(80∶20)溶液，在水平摇床上振摇40 min，用定量滤纸粗滤，取10 mL滤液加40 mL纯水，混匀。将上述稀释后的滤液用玻璃纤维滤纸过滤，移取滤液20 mL(相当于1.0 g样品)过Afla－P黄曲霉毒素免疫亲和柱，调节流速为1滴/s，直至空气完全通过免疫亲和柱。用20 mL纯水以2～3滴/s清洗免疫亲和柱，直至空气完全通过免疫亲和柱。加入1 mL甲醇，调节流速至1滴/s，将免疫亲和柱中的黄曲霉毒素淋洗下来。洗脱液用氮气在40℃时吹干，用甲醇 －水(50∶50)定容至1 mL，振荡混匀后，过0.45 μm有机滤膜，供测定用。

2.3 方法学考察

线性关系考察∶取混合对照品溶液(黄曲霉毒素 G2，G1，B2，B1质量浓度分别为 0.3，1.0，0.3，1.0 μg/mL)，配制成一系列(G1，B1)质量浓度为 1.0，2.5，5.0，15.0，25.0，50.0，75.0 ng/mL 的混合对照品溶液，分别进样25 μL，记录色谱图。以黄曲霉毒素对照品溶液质量浓度为横坐标(X)、峰面积积分值为纵坐标(Y)绘制标准曲线，计算得回归方程见表1。

表1 黄曲霉毒素的线性回归方程、相关系数及线性范围

精密度试验:取混合对照品溶液，配制成黄曲霉毒素G2，G1，B2，B1质量浓度分别为 3，10，3，10 ng/mL 的对照品溶液，连续进样6 次。结果黄曲霉毒素 G2，G1，B2，B1峰面积的 RSD 分别为 0.6% ，0.2% ，0.6%，0.4%(n=6)，表明仪器精密度良好。

重复性试验∶精密称取同种空白样品粉末12.5 g，共6份，分别精密加入混合对照品贮备液50 μL，按2.2项下方法制备供试品溶液，进样测定。结果各样品中黄曲霉毒素4组峰面积的 RSD为1.3% ～ 5.6%(n=6)。

稳定性试验∶精密称取空白样品粉末12.5 g，精密加入黄曲霉毒素 G2，G1，B2，B1质量浓度分别为 3，10，3，10 ng/mL 的对照品溶液，按 2.2项下方法制备供试品溶液，于配制后0，5，12，27 h时取样分析。结果样品中黄曲霉毒素4组峰面积的 RSD为0.3% ～3.4%，表明供试品溶液在27 h内基本稳定。

回收率试验∶选取地龙、鸡内金、蛇蜕3种空白药材(分别属于全动物类、脏器类、生理病理产物)分别代表常用动物药的3种基质，且这3种药材经过免疫亲和柱处理之后进行检测，对添加的对照品无干扰。本试验添加了3个水平的混合对照品溶液，每个水平重复3次，计算平均回收率。结果见表2。

表2 不同样品中黄曲霉毒素的回收率

检测限∶在空白样品中加入对照品，根据3倍信噪比的峰响应值，得出黄曲霉毒素 G2，G1，B2，B1的方法检测限分别为 0.15，0.25，0.10，0.20 μg/kg。

2.4 样品检测

依法测定17种动物类药材，包括水蛭(湖北)、全蝎(河北)、蜈蚣(湖北)、土鳖虫(江西)、蕲蛇(湖南)、乌梢蛇(四川)、僵蚕(湖北 )、五灵脂(吉林)、夜明砂 (湖北 )、望月砂 (湖北 )、蝉蜕 (湖北 )、蛇蜕(湖南)、紫河车(湖北)、桑螵蛸(湖北)、龟甲(浙江)、鳖甲(浙江)、穿山甲(广西)，其中僵蚕、土鳖虫测定结果呈阳性(如图1所示)。土鳖虫中黄曲霉毒素G2，G1，B2，B1含量分别为 0.9，4.1，0.3，1.1 μg/kg，总量达到6.4 μg/kg，有轻微污染;僵蚕中黄曲霉毒素G1含量为1 μg/kg，未检出黄曲霉毒素 G2，B2，B1，污染水平低于2010年版《中国药典(一部)》中的规定(黄曲霉毒素 B1不得高于 5 μg/kg，总黄曲霉毒素不得高于10 μg/kg)。

图1 检测限图谱

3 讨论

本试验中，从高效液相色谱仪洗脱出来的样品液流经光化学衍生器的网状通路时，经紫外光照射，流动相光解出具有荧光特性的基团，与黄曲霉毒素B1和G1分子上的活性双键发生羟基化反应，生成荧光特性更强、更稳定的物质，解决了黄曲霉毒素B1和G1在水溶液中的荧光淬灭现象[8]。光化学衍生装置直接连在色谱柱和荧光检测器之间，不需要在流动相中添加任何试剂，操作较简易且灵敏度较高。

从样品检测结果可知，土鳖虫中黄曲霉毒素总量达到6.4 μg/kg，超出药典的限量标准。因此，动物药材中黄曲霉毒素的污染应引起重视。

笔者首次采用免疫亲和柱净化、光化学衍生后高效液相色谱－荧光法测定动物药材中黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的含量，这种方法不需要特殊的化学试剂和增加额外的泵，且灵敏度高、重现性好，适合动物药材中黄曲霉毒素的快速定量分析，可为相关标准的制订提供参考。

[1]杨美华.药用植物及其产品中真菌及真菌毒素污染研究进展[J].贵州农业科学，2008，36(6):59 －63.

[2](EU)NO.165/2010，Setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs as regards aflatoxins[S].

[3]刘晓霞，傅武胜，吴锦忠.植物药中黄曲霉毒素现代分析方法概况[J].海峡预防医学杂志，2010，16(2):28－31.

[4]张爱婷.中药黄曲霉毒素含量测定及限度标准的研究[J].光明中医，2008，23(11):1 668 － 1 669.

[5]吴兆蕃.黄曲霉毒素的研究进展[J].甘肃科技，2010，26(18):89－92.

[6]黄惠明，徐群英，胡 敏.黄曲霉毒素检测方法研究的概述[J].中国卫生检验，2001，11(4):510 －512.

[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:附录61.

[8]陈 新，王 雄，雷 达.免疫亲和－光化学柱后衍生高效液相色谱荧光法测定花生粕中黄曲霉毒素的研究[J].中国饲料，2007，(24):30－34.