载脂蛋白A5基因多态性与冠心病的相关性研究

03000 山西太原解放军6医院 陈毓徐丽萍张峻青

066100 北京军区北戴河疗养院 李荣3

载脂蛋白A5基因 (apolipoprotein A5 gene，ApoA5)是2001年分别由Pennacchio和Vliet两个研究小组通过比较小鼠与人的基因组DNA而发现的一种新的载脂蛋白基因[1]。它位于11号染色体长臂23区的ApoA1/C3/A4基因簇上游30 kb处，基因全长1 889 bp，因其与脂质特别是三酰甘油(TG)代谢的关系密切而成为许多学者研究的重点。

对该基因序列的单核苷酸多态性(SNP)进行分析发现有14个常见的位点，其中ApoA5-1131T/C基因多态性对血浆TG影响较大[2-3]。而血浆TG水平的升高是冠心病(CHD)的独立危险因素[4]。因此，我们研究太原地区汉族人群ApoA5-1131T/C基因多态性的分布特点及其与血脂、脂蛋白的相关性，以期从遗传学角度探讨ApoA5基因变异与CHD发生的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 CHD组：太原解放军264医院及太原医院住院CHD患者共249例，男153例，女96例；年龄37～87岁，平均年龄(60.5±14.8)岁；所有患者在近日服用降脂药物，并经冠状动脉造影证实为CHD。正常对照组：共176名，男115名，女61名；平均年龄(55.8±13.2)岁；均为门诊查体人员，经过检查均排除CHD。两组患者均除外可能影响血脂的系统性疾病，均无血缘关系。

1.2 研究方法

1.2.1 生化指标测定 研究对象均空腹采血，采用酶比色法测定血浆胆固醇(TC)、TG含量，采用直接匀相法测定高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，通过罗氏全自动生化分析仪进行测定。

1.2.2 ApoA5-1131T/C基因型检测 取外周血5 mL，用1 mL酸性的枸橼酸-葡萄糖ACD抗凝，摇匀，用盐析法抽提DNA，-20℃保存备用。根据文献设计ApoA5扩增引物：正 向 引 物 5′-GAT TGA TTC AAG ATG CAT TTA GGA C-3′，反向引物5′-CCC CAG GAA CTG GAG CGA AAT T-3′(北京奥科生物技术有限公司合成)。PCR反应条件：96 ℃预变性5 min，96 ℃变性45 s、59 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s、循环35次，末次循环后72℃延伸7 min。PCR扩增产物用限制性内切酶MseⅠ(MBI公司)消化过夜，酶切产物经3%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后，在紫外线灯下观察，判断结果。

1.3 统计学分析 结果均以SPSS 11.0软件分析。基因型和基因频率采用基因计数法，研究对象与Hardy-Weinberg平衡的符合程度，基因型和等位基因的组间比较采用χ2检验，Logistis回归用来校正年龄、性别、BMI及血清TC、HDL-C、LDL-C水平等其他CHD的发生相关因素对其可能产生的影响。组间血脂水平比较用t检验，对CHD组ApoA5基因型与血脂关系的比较用方差分析。计量资料用均值±标准差(±s)表示，符合正态分布者进行χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CHD组与对照组血脂测定结果对比分析(表1) 结果显示，CHD组与对照组比较，TC、HDL-C和LDL-C明显低于对照组，而TG则明显高于对照组(P＜0.05)。

表1 CHD组与对照组血脂水平测定结果(±s)

表1 CHD组与对照组血脂水平测定结果(±s)

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

血脂(mmol/L) 对照组(n=176) CHD组(n=249)TC 4.92±0.88 4.51±1.18*TG 1.26±0.64 2.26±1.83**HDL-C 1.66±0.38 1.12±0.37*LDL-C 2.99±0.79 2.64±0.73*

2.2 ApoA5的基因多态性分析(图1) ApoA5基因的PCR扩增片段大小为154 bp，Mse I酶切片段有3种：154 bp、133 bp和21 bp。若为TT型，有133 bp、21 bp 2条带；若为TC型，有154 bp、133 bp、21 bp 3条带；若为CC型有154 bp 1条带。由于21 bp的分子量小，游动速度快，可能已经跑出胶外，图中没有显示。在凝胶电泳中仅出现一条154 bp的CC基因型纯合子；一条133 bp和一条154 bp的TC基因型的杂合子；仅出现一条133 bp的TT基因型纯合子。

图1 ApoA5基因多态性分析

2.3 ApoA5基因型与CHD患者血脂水平的关系 CHD组ApoA5-1131T＞C的多态性不同基因型亚组间的血脂水平(表2)，TG水平差异有统计学意义(P＜0.01)，即CC组明显高于TC组、TC组明显高于TT组。其他血脂指标差异无统计学意义。

表2 CHD组不同基因型血脂水平比较

2.4 ApoA5等位基因和基因频率的分布(表3) CHD组和对照组中ApoA5-1131T/C的基因型分布经Hardy Weinberg检验，符合遗传平衡，具有群体代表性。在测定的样本中，以TC较为多见，TT适中，CC较少。等位基因C的频率在CHD组显著低于对照组(P＜0.05)。

表3 CHD组和对照组ApoA5-1131T/C基因的基因型和等位基因频率分布

2.5 ApoA5基因与CHD的相关性分析 如表3所示，ApoA5的基因型频率，CHD组与对照组间比较，差异有统计学意义(χ2=7.76，P=0.012)。CHD组C等位基因频率明显低于对照组(37.1%VS 42.0%，P=0.023)。分析显示：CC型患CHD的风险是TT型的近3倍。

3 讨论

ApoA5基因是通过小鼠基因组序列进行比较而找到的，位于11q23染色体上。研究发现[4]，过度表达人类ApoA5的基因鼠，其血浆TG水平降低；与野生型对照鼠比较，ApoA5基因敲除小鼠血浆TG水平上升3倍，这些研究提示，ApoA5是影响血浆TG浓度的重要因素之一。

我们通过对太原地区249例CHD患者和176例正常人的ApoA5-1131T/C基因多态性与血脂水平进行相关性分析，结果显示CHD组ApoA5-1131T/C的多态性不同基因型亚组间的TG水平呈显著性差异(P＜0.01)，即CC组明显高于TC组、TC组明显高于TT组。CHD组C等位基因频率明显高于对照组，CC型患CHD的风险是TT型的近3倍。本文研究提示，CHD组的血脂水平分析，其中TG和HDL-C的结果与国内外的报道基本一致，但LDL-C的结果与其他CHD组的报道有差异，是否与住院使用降脂药有关，有待进一步探讨。总之，本研究提示太原地区汉族人群ApoA5-1131C等位基因存在差异，并且与CHD的发生有一定的关联。

近年来对于ApoA5基因多态性与心脑血管疾病之间的关系研究越来越多。Hubacek等发现ApoA5-1131CC纯合子更易发生心梗[5]；毕楠等报道ApoA5-1131C等位基因可能与我国北方汉族人CHD的发生相关联[6]；还有研究认为，ApoA5-1131C等位基因不仅与CHD等心脑血管疾病相关，而且可能是CHD等心脑血管疾病的一个保护因素[7]。明确二者的相互关系及作用机制，有助于CHD等脂质代谢相关疾病的预防和治疗。

[1]Van der Vliet HN，Sammels MG，Leegwater AC，et al.Apoliprotein A-V：a novel apolipoprotein associated with an early phase of liver regeneration[J].J Biol Chem，2001，276(48)：44512-44520.

[2]Pennacchio LA，Olivier M，Hubacek JA，et al.An apolipoprotein influencing triglycerides in humans and mice revealed by comparative sequencing[J].Science，2001，294(5540)：169-173.

[3]Pennacchio LA，Rubin EM.Comparativegenomictoolsand databases：providing insights into the human genome[J].J Clin Invest，2003，111(8)：1099-1106.

[4]Pennacchio LA，Olivier M，Hubacek JA，et al.An apolipoprotein influencing triglycerides in humans and mice revealed by comparative sequencing[J].Science，2001，294(5540)：169-173.

[5]Hubacek JA，Skodová Z，Adámková V，et al.The influ ence of APOAV polymorphism(T-1131/C and S19/W)on plasma triglyceride levels and risk of myocardial infarction[J].Clin Genet，2004，65(2)：126-130.

[6]毕楠，鄢盛恺，李国平，等.冠心病患者载脂蛋白A5和载脂蛋白C3基因多态性的研究[J].中华心血管病杂志，2005，33(2)：116-121.