不同剂量酒精对大鼠心肌组织的影响

毛 华,杜 峰,乔更生,朱晋坤,刘廷筑,文 美,李 羚

(贵州省贵阳市第一人民医院心内科,贵州贵阳,550002)

乙醇(ethanol,alcohol)是一种日常生活中常见的饮料和药物,其日益成为人们生活中不可缺少的“润滑剂”。适度饮用,可以减轻疲劳,增加愉快的感觉,尤其是可减少冠心病、动脉粥样硬化等疾病的发病率及病死率,但过量饮酒甚至嗜酒,可导致心肌毒性,造成心肌细胞水肿、变性、坏死等。饮酒量与心血管发病率之间存在着一种U型关系[1]。因此,饮酒对心脏的影响及其发病机制越来越引起人们的关注。本研究通过给予不同剂量的酒精,建立饮酒的动物模型,动态观察乙醇对大鼠心肌细胞形态学及心肌损伤标志物的影响,旨在探讨预防乙醇性心肌损害的合适的饮酒量。

1 资料与方法

1.1 实验材料

健康Sprague-Dawley大鼠 140只,2～3个月龄,体质量180～220 g,雌雄各半(贵阳医学院实验动物中心提供)。53度赖茅酒(贵州赖茅酒厂);即用型免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);血清生化肌酸激酶同工酶(CKMB)、肌钙蛋白 T(cTnT)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物模型的制作及分组:将140只大鼠按体重编号,并按随机排列表将其分成7组:正常对照组及模型组(6个不同剂量乙醇灌胃模型组),即:0.8 mL/(kg·d)(A 组),1.6 mL/(kg·d)(B组),并按随机排列表将其随机2.4 mL/(kg·d)(C 组)3.2 mL/(kg·d)(D 组),4.0 mL/(kg·d)(E组),4.8 mL/(kg·d)(F组),每组各 20只(其中15只大鼠因灌胃窒息及被其他大鼠咬伤致死)。

灌胃量的计算:通过预实验,将最高乙醇剂量定为4.8 mL/(kg·d)较安全,高于此标准易造成动物死亡,中间剂量组设为2.4 mL/(kg·d)、3.2 mL/(kg·d)、4.0 mL/(kg·d)3 组 ,低剂量组设为0.8 mL/(kg·d)、1.6 mL/(kg·d)2 组。动物灌胃容量为 10 mL/(kg·d)(A 、B 、C 、D、E 、F 组乙醇分别用蒸馏水按 2/23 、4/21、6/19、8/17、2/3、12/13稀释),对照组给予10 mL/kg的生理盐水灌胃。灌胃时间为16周,每周6次,每周称1次体重。灌胃16周后各组大鼠禁食12 h后颈总静脉取血4 mL,离心制备血清,-20℃保存待测。

1.2.2 心肌组织标本的制备与检测:处死动物后,各组大鼠取下心脏置于4%多聚甲醛溶液中,4℃再固定6 h,用0.01 mmoL/L磷酸缓冲生理盐水(PBS)冲洗24 h,常规梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,连续切片,厚5 pm,做苏木精-伊红(HE)染色,光镜观察。

1.2.3 观察指标:检测各组大鼠血清中CKMB与cTnT、hs-CRP的水平。光镜下观察心肌组织形态学改变。

2 结 果

2.1 不同剂量的酒精对大鼠CK-MB、cTnT的影响

乙醇对大鼠CK-MB、cTnT水平的影响见表1。模型A、B组与正常对照组相比CK-MB、cTnT水平无明显升高,差异无统计学意义(P>0.05);模型 C、D、E、F组与正常对照组及 A、B组相比CK-MB、cTnT水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 不同剂量的白酒对大鼠血hs-CRP的影响

乙醇对大鼠hs-CRP的影响见表2。模型A、B组与正常对照组相比hs-CRP水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);模型 D、E、F组与正常对照组相比hs-CRP水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);模型C组与正常对照组相比hs-CRP水平略有升高,但差异无统计学意义(P>0.05);正常对照组、模型 C、D、E、F组与A、B组比较hs-CRP水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 白酒对大鼠CK-MB、cTnT的影响(±s)

表1 白酒对大鼠CK-MB、cTnT的影响(±s)

注:与对照组比较,＊＊P<0.01;与A组比P<0.01;与B组比##P<0.01。

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表2 白酒对大鼠hs-CRP的影响(±s)

表2 白酒对大鼠hs-CRP的影响(±s)

注:与对照组比较,＊P<0.05;与A组比较,P<0.05;与B组比较,#P<0.05。

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2.3 心肌组织HE染色结果

心肌组织HE染色结果显示:正常对照组、A组、B组C组小鼠心肌细胞排列整齐,肌纤维走向明晰,细胞分界清楚,细胞核呈蓝色,胞质呈淡红色,未见明显异常的细胞核,间质无明显水肿及炎性细胞浸润,仅示冠状动脉轻度扩张充血(图1A～D)。D组、E组、F组小鼠心肌细胞排列欠整齐,肌纤维走向紊乱;胞质嗜酸性增强,胞核固缩、碎裂或消失的凋亡细胞明显增多;组胞膜不清、胞质淡染、部分细胞空泡变性、片状黏液变性及不同程度的坏死;心肌间质不同程度水肿(图1E～G)。

3 讨 论

CK-MB、cTnT是一种高灵敏度高特异性的心肌标志物,临床常用来间接衡量心肌细胞损害程度。既往研究显示[2-3],长期饮酒导致心肌的生化改变是直接或间接由乙醇或其代谢产物影响了心肌能量产生和代谢的缺陷,使肌纤维溶解,肌质网畸变,甚至坏死,细胞膜的完整性遭到破坏,细胞内大分子物质弥散至心脏间质组织,最后进入坏死区的微血管和淋巴结等组织,导致患者血清CK-MB、cTnT浓度升高[4]。

图1 正常对照组及各剂量模型组小鼠心肌细胞组织病理像 (HE染色 200倍)

徐根云等[5]曾对健康志愿者进行了急性乙醇摄入后的心肌酶进行检测,结果当乙醇浓度>1.2 g/L时,CK-MB有明显升高。本实验结果显示,模型(摄入>2.4 mL/(kg·d))C 、D、E、F 组与正常对照组及模型A、B组比较CK-MB、cT-nT水平明显升高;而模型A、B组与正常对照组相比CK-MB、cTnT水平无明显变化。与他人研究结果相似,为大剂量饮酒所致的心肌损伤提供了实验依据。

hs-CRP作为心血管疾病的独立危险因子,是机体非特异性炎性反应的敏感标志物之一,其合成与致炎因子密切相关,可反映这些细胞因子的变化过程,当细胞或组织损伤时,机体产生急性时相反应,血清hs-CRP浓度显著升高[6]。

Fronhlich等[7]测定206例急性乙醇中毒患者的血清hs-CRP,结果显示随着患者的乙醇血浓度的增加,血清hs-CRP水平相应升高。张世阳等[8]发现血清hs-CRP水平与急性乙醇中毒患者靶器官损害的范围、程度呈正相关,并且提出动态检测hs-CRP变化有助于评价急性乙醇中毒靶器官的损害。有研究者对2 006名德国人的乙醇摄人量与CRP水平之间的关系进行分析,结果发现中等饮酒者(乙醇40～60 g/d)的CRP水平低于不饮酒者和大量饮酒者(乙醇>80 g/d)。这些研究提示hs-CRP水平与饮酒量及靶器官损害之间存在关联。

本实验结果显示,随着灌喂乙醇剂量的增加,hs-CRP有先降低后升高的趋势,与正常对照组相比模型A、B组的hs-CRP明显降低。随着灌胃大鼠白酒浓度的增加,C、D、E、F组hs-CRP水平明显升高。因此笔者推测,适量饮酒可以通过降低hs-CRP水平而降低炎症和免疫反应,起到心脏保护作用;过量摄入乙醇可造成的心肌损伤,与炎症和自身免疫有关。

长期摄入乙醇对心肌的毒性作用可能为乙醇直接影响心肌细胞对脂肪酸的利用并损伤细胞膜的完整性,使其通透性增加;另外,乙醇代谢产物乙醛可与许多蛋白结合,使某些蛋白丧失正常生理功能,从而造成心肌损伤[3]。既往研究显示,酗酒导致的心肌组织学改变主要有心肌细胞结构紊乱、肥大、松弛、苍白,伴弥漫性退行性变,心肌细胞横纹消失,胞核皱缩变小,肌纤维空泡、水肿、脂肪、透明样变性等心肌损伤特征。

笔者观察到,心肌组织结构的改变与白酒的摄入量成正相关,模型A、B、C组未见心肌细胞异常变化;但随着剂量的增大,模型D、E、F组心肌细胞即发生心肌细胞排列欠整齐,肌纤维走向紊乱,可见体积缩小,胞质嗜酸性增强,胞核固缩、碎裂或消失等改变。亦可见组胞膜不清、胞质淡染、部分细胞空泡变性及不同程度的坏死;心肌间质不同程度水肿;且随着饮酒量的增加,异常越来越显著。提示长期大剂量的摄入白酒可造成较严重的心肌组织病理性改变,当各种结构损伤达到一定程度时必然会出现心肌功能减退。

本文研究结果显示:①适量饮酒可以通过降低hs-CRP而降低炎症反应,保护心肌细胞。随着白酒剂量的增加,hs-CRP有先降低后升高的趋势,提示过量饮酒造成的心肌损伤可能与急性炎症有关。②过量[>2.4 mL/(kg·d)]乙醇摄入可导致心肌损伤标志物升高及心肌细胞组织病理学改变。③由于动物与人体间存在一定的差异,且对饮酒量(小、中、大)没有统一的和准确的标准,故该实验结果应用到人还有待于进一步深入验证。

[1]Qun L,Jun R.Cardiac overexpression of metallothionein rescues chronic alcohol intake-induced cardiomyocyte dysfunction:role of AKT,mammalian target of rapamycin and ribosomal P70S 6 kinase[J].Alcohol&Alcoholism,2006,4l(6):585.

[2]Wannamethee S G,Shaper A G.Alcohol,body weight,and weight gajn in middle-aged men[J].Am J Clin Clin Nutr,2003,77:1312.

[3]Gaziano J M,Gaziano T A,Glynn R J,et al.Light tomoderate alcohol consumption and mortality in the physicians health study enrollment cohort[J].Am Coil Cardiol,2000,35:96.

[4]刘子永,罗小英,吕惠荣.急性白酒中毒对心脏损害[J].临床和实验医学杂志,2006,5(6):747.

[5]徐根云,虞朝辉,乐 敏,等.急性酒精摄入致酶谱变化的实验研究[J].中华检验医学杂志,2003,26(7):417.

[6]Lazarus N B,Kaplan G A,Cohen R D,et al.Change in alcohol consumption and risk of death from all causes and from ischaemic heart disease[J].Br Med J,2002,303:553.

[7]Frohlich M,lmhof A,Berg G,et al.Association between C-reactive protein and features of the metabolic syndrome:a population-based study[J].Diabetes Care,2000,23(12):1835.[J]

[8]张世阳,谈 敏.C反应蛋白与代谢综合征[J].中国临床保健杂志,2007,26(5):145.