巴戟天糖链对缺氧复氧损伤内皮细胞的血管形成作用研究

王 宁，周 鹏，2，冯国清，刘心玉，张培君，吴 斌，胡香杰，乔 鹏

(1.郑州大学基础医学院药理学教研室，河南郑州 450052;2.河南中医学院一附院，河南郑州 450001)

巴戟天(radix morinda officinalis，RMO)为茜草科植物，肉质根入药，是我国著名的四大南药之一，具有传统的补肾壮阳、强筋骨，祛风湿等作用。巴戟天糖链(morindae officinalis oligosaccharides，MOO)是巴戟天醇提物的主要有效成分，本课题组既往研究表明，MOO具有明显的减轻缺氧/复氧或缺血/再灌注对心肌的损伤［1］。可以促进鸡胚绒毛尿囊血管生成［2］;增加MVD的数量，而且上调与血管新生相关的VEGF、bFGF蛋白的表达，具有促进缺血心肌血管新生的作用［3］。本实验选择HUVEC为研究对象，首次从细胞水平观察MOO对缺氧损伤内皮细胞迁移及管腔样结构形成的影响，旨在进一步观察MOO促血管生成效应，并为其在缺血心肌保护及促进缺血心脏建立侧枝循环方面的作用提供更加直观的实验依据。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验细胞 人脐静脉内皮细胞(HUVEC)郑州大学生物系多肽生化实验室祁元明老师惠赠。

1.1.2主要药品及试剂 巴戟天糖链(Morinda officinalis oligosaccharides)的制备:巴戟天(购自广东省德庆县药材公司，一等品，河南省药品检验所李杰鉴定)生药15 kg粉碎后，分次用体积分数为0.70的乙醇在90℃水浴中煮60 min，将乙醇提取液旋蒸回收乙醇，得浓缩液。用适量的蒸馏水稀释后，分别用乙醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，弃去乙醚、乙酸乙酯、正丁醇可溶部分，得到醇提物的水溶部分，用层析柱方法分离收集糖链部分，其纯度为98.76%。实验用蒸馏水稀释配成9.0、3.0、1.0 g·L-13种浓度药液备用;麝香保心丸，上海和黄药业有限公司，取1 g加入无血清RPMI 1640中研磨制成20 ml混悬液，1 500 r·min-1离心去沉淀，再用 0.22 μm 微孔滤膜过滤，4℃保存;Matrigel，BD公司;RPMI 1640培养基，美国Gibco公司产品;胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.1.3主要仪器 CO2细胞培养箱，美国Thermo公司;倒置显微镜，日本Nikon公司;超低温高速离心机D-37520，德国Heraeus公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养 HUVEC细胞接种到50 ml玻璃培养瓶中，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，置于37℃、体积分数为0.05的CO2的培养箱内培养。当培养瓶细胞长到80%左右时用胰蛋白酶(含EDTA)消化传代。加入体积分数0.1的胎牛血清及1×105U·L-1青霉素和100 mg·L-1链霉素的RPMI 1640培养基悬浮细胞，以1×108·L-1的密度接种到新细胞培养瓶中，轻轻置于培养箱内培养。选取3～8代生长状态良好的细胞用于模型制备。

1.2.2细胞缺氧/复氧损伤模型制备及分组 根据文献［4］的方法，采用氧清除剂连二亚硫酸钠造成缺氧，种板培养24 h后，各孔弃去培养基，用无糖Earle's液洗细胞2次，正常对照组加入RPMI 1640培养基;模型组加入含连二亚硫酸钠终浓度为1×10-3mol的无糖 Earle's液，造成细胞缺氧损伤［5］;阳性药对照组加入麝香保心丸(SBW，2 g·L-1)，MOO各组加入含连二亚硫酸钠终浓度为1×10-3mol的无糖Earle's液及MOO大(0.45 g·L-1)、中(0.15 g·L-1)、小(0.05 g·L-1)，37 ℃孵育 4 h;取出培养板，吸弃各实验孔液体，用无糖Earle's液洗细胞2次，各实验孔均换含药的无血清 RPMI 1640培养基，继续培养12 h，造成细胞复氧损伤。

1.2.3细胞生长状况检测 6孔培养板每孔接种1×105个HUVEC，培养24 h待其贴壁后，每孔改用含10%胎牛血清培养液同步化处理24 h后并按上述方法进行处理，收获细胞，加入终浓度为100 μg的RNA酶，37℃水浴30 min后，加入终浓度50 μg的PI荧光染料避光染色30 min，用流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.4内皮细胞体外迁移实验 HUVEC在缺氧4 h复氧12 h后收获，按文献方法［6］24孔板每孔加入600 μl正常培养基，放置小室，向小室中加入细胞悬液 100 μl(1 ×108·L-1)，模型组加入等量 PBS，阳性药物组加入SBW，各给药组加入大、中、小剂量的MOO，每组均设置3个复孔，37℃培养4 h。去除滤膜上层细胞，用体积分数0.95的乙醇固定后胎盘蓝染色。显微镜下计数滤膜下表面的细胞数，随机选取8个视野。

1.2.5内皮细胞体外小管形成实验 参照文献［6］的方法。HUVEC在缺氧复氧处理后收获，制成2×107·L-1细胞悬液。96孔板每孔加入50 μl Matrigal，37℃条件下温育4 h后每孔加入上述细胞悬液100 μl，模型组加入等量 PBS，阳性对照组加入SBW，MOO各组分别加入大、中、小剂量的MOO，每组均设置3个复孔，37℃条件下培养。18 h后观察各组细胞管状排列状况及管状结构数量、完整程度，并随机选取5个视野，应用Image J软件分析显微镜下每个视野总的小管面积数量，结果以与模型对照组相比的百分数表示。

1.2.6统计学处理计量资料数据用±s表示，采用统计学软件SPSS 16.0进行方差齐性检验、单因素方差分析，组间用LSD法进行两两比较。

2 结果

2.1缺氧复氧损伤对HUVEC细胞形态学的影响正常培养的HUVEC细胞核圆，核膜清晰，呈铺路石样单层生长模式;缺氧复氧模型后，细胞形态不规则，细胞部分脱落，间隙变大，单个细胞体积膨大，胞膜呈粗糙褶皱状，有拉丝现象;SBW组大部分脱落，MOO各剂量组对HUVEC细胞缺氧复氧损伤均显示出不同程度的保护作用。

2.2流式细胞仪检验细胞生长状况如Tab 1所示，正常组与缺氧复氧模型组G2+S期的细胞分别占(26.25±1.44)%和(50.07±4.07)%，两者差异有显著性(P＜0.05);MOO大、中剂量G2+S期细胞为(28.24±2.13)%和(34.23±2.56)%，与模型组差异有显著性(P＜0.05)。

Tab 1 Effect of MOO on cell cycle in HUVECS injured by hypoxia/reoxygenation

2.3巴戟天对缺氧复氧损伤条件下的细胞迁移的影响如Tab 2所示模型组与正常组相比，细胞迁移数量明显减少(P＜0.05);MOO各剂量组可明显增加缺氧复氧模型组细胞的迁移数目(P＜0.05)。阳性对照药组未表现出促进缺氧复氧损伤的内皮细胞迁移的作用。

Tab 2 Effect of MOO on migration of cells injured by hypoxia/reoxygenation(x¯±s)

2.4MOO对缺氧复氧损伤细胞小管形成的影响如Tab 3所示，正常组与模型组细胞形成的管腔结构数量差别有统计学意义(P＜0.05)，模型组与给药组相比差别亦有统计学意义(P＜0.05)，SBW组细胞状态不好，未见有小管形成(Fig 1)。

3 讨论

治疗性血管新生是指在心衰、心肌缺血、心肌梗死的状态下，通过一些方法的刺激包括某些药物的治疗作用增加功能性的冠状动脉分支或侧支循环的建立或开放，达到恢复缺血心肌血供的目的，它为冠心病患者带来了一种新的治疗策略［7］。内皮细胞对于血管新生有着很重要的作用［8-9］，故本实验选用HUVEC为研究对象。

Fig 1 Effect of MOO on tube formation of cells injured by hypoxia/reoxygenation

Tab 3 Effect of MOO on tube formation of cells injured by hypoxia/reoxygenation(x¯±s)

细胞凋亡是心肌细胞急性损伤过程中心肌细胞丢失造成心肌受损的重要原因，抗细胞凋亡可以对抗心肌的急性缺氧/复氧损伤［10］。巴戟天能够对缺氧/复氧过程中的心肌细胞的形态具有保护作用［11］。本实验结果也显示各剂量组MOO处理后在未增加细胞G2+S期比例情况下却能减少细胞脱落，表明巴戟天糖链具有抑制细胞凋亡和促进内皮细胞增殖的双重作用，从而起到保护缺血心肌的作用。

血管新生是一个复杂过程，单就内皮细胞而言，主要有迁移、增殖和管腔形成等几个步骤［12］。缺血缺氧是诱导血管形成的原因之一［13］，而血管内皮细胞的迁移和管腔形成是血管新生的重要环节［14］，促进内皮细胞迁移和小管形成，可能是促治疗性血管生成的机制之一［15］。本实验结果显示，在缺氧复氧损伤情况下细胞的迁移却受到了抑制，迁移的细胞数量不足正常条件下的一半，而巴戟天糖链能够在缺氧复氧损伤条件下促进细胞迁移，使迁移的细胞数量维持在一个很高的水平。同时在小管形成实验中，缺氧复氧损伤模型组细胞在18 h后才开始相互连接，24 h未能在基质胶表面形成完整的管腔样结构，而MOO大、中、小剂量组细胞培养6 h即可见有细胞间的相互连接形态，18 h在martrigel表面形成完整的管腔样结构，并随着浓度的增加和培养时间的延长，管腔结构增多，促进缺氧复氧损伤条件下的小管形成。这表明MOO促进血管内皮细胞血管新生，对MOO既往药理研究有了进一步补充，为缺血心肌保护及促进缺血心脏建立侧枝循环方面的作用提供了更加直观的实验依据。

本实验中还存在问题，实验中设定的阳性药物麝香保心丸组(SBW)在本实验中并没有表现出来其应有的作用，可能是制备过程中或者给药剂量方面的问题，我们将在下一步的实验中对其查证或换用其他阳性药物。

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