松果菊苷对脑缺血大鼠纹状体细胞外液中单胺类神经递质的影响

魏丽丽，陈 虹，姜 勇，屠鹏飞，钟 明，杜 娟，刘 斐，刘春阳，王 磊

(1.石河子大学药学院，教育部新疆特种植物药重点实验室，新疆石河子 832002;2.北京大学中医药现代研究中心，北京 100083)

松果菊苷(echinacoside，ECH)是从新疆特色植物药管花肉苁蓉中分离、纯化的一种苯乙醇苷类有效成分。研究表明，ECH具有抗氧化［1-2］、保护神经［3-4］、抗衰老［5］、改善学习记忆［6-8］等神经保护作用。陈虹等的研究结果证实，ECH对帕金森病的DA能神经元具有保护作用［9］。单胺类神经递质是一类调节机体生理活动的重要物质，组织中的含量能反映神经递质生物合成、释放、摄取、失活等过程［10-11］。目前关于ECH对脑缺血大鼠脑内单胺类递质的影响尚未见相关报道。本研究运用脑微透析技术，考察了ECH对脑缺血大鼠纹状体细胞外液中各单胺类神经递质含量的影响，初步探讨了ECH对脑神经保护的可能机制。

1 材料

1.1实验动物SD大鼠，♂，体质量250～300 g(购于新疆实验动物中心，许可证编号:2009-0053)。

1.2药品和试剂ECH由北京大学药学院屠鹏飞教授惠赠(纯度95%以上);去甲肾上腺素(NE)、多巴胺 (DA)、5-羟色胺 (5-HT)、3，4-二羟苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)、5-羟吲哚乙酸(HIAA)均为Sigma公司;注射用盐酸川芎嗪(CXQ，哈尔滨三联药业有限公司);磷酸锌水门汀(上海医疗器械股份有限公司产品，由液体和粉剂组成，用时调和);1-烷基硫酸钠(DIKMA公司);水合柠檬酸(天津市津科精细化工研究所);柠檬酸三钠(Acros公司);乙二胺四乙酸二钠(J T Baker Chemical co);甲醇(DIKMA公司);乙腈(DIKMA公司);脑微透析灌流液为复方氯化钠注射液(北京双鹤药业股份有限公司);所用水均为重蒸水。

1.3仪器美国BAS4100型大鼠脑立体定位仪;CMA/12探针及探针套管;CMA/120清醒动物装置;CMA/402微量泵;CMA/150低温样品自动收集器。Esa公司5600A型输液泵;Esa公司5600A型输液泵;Esa公司542型自动进样装置;Esa公司CoulArray电化学检测器;玻璃碳工作电极和Ag/AgCl参考电极;C18色谱柱(DIKMA 公司，ODS 5 μm，150 mm×4.6 mm);CoulArray win色谱工作站(Esa公司);漩涡混旋器(QL-861型);台式酸度测定仪(HANNA-211型);台式高速离心机(XYJ-2型)。

2 方法

2.1动物分组及给药大鼠30只，随机分为5组:① 对照组(Control):生理盐水1 ml·kg-1·d-1;②模型组(Model):生理盐水1 ml·kg-1·d-1;③ 模型+川芎嗪(CXQ)30 mg·kg-1·d-1;④～⑤ 模型+ECH 高、低剂量组(ECHB，ECHS):30、15 mg·kg-1·d-1;各组动物均腹腔注射给药7 d。

2.2造模方法和微透析每只大鼠均于给药第3天埋置套管:将大鼠用10%水合氯醛(3.5 ml·kg-1)麻醉，固定于BAS 4100脑立体定位仪，参照George Paxinos《大鼠脑立体定位图谱》将探针导管植入左侧纹状体(坐标AP:+0.2 mm;ML:-3.0 mm;DV:-3.5 mm)，末次给药1 h后麻醉，采用杨赞章［12］改进Longa线拴法制作大鼠大脑局灶型脑缺血模型(MCAO模型)。对照组鱼线仅插入10 mm，其余步骤同手术组。造模后在清醒自由活动状态下插入微透析探针，用Ringer液以1.5 μl·min-1的速度灌流，4℃下收集脑微透析液，20 min收集1管透析液。每管透析液收集完毕后均立即置于-20℃冰箱保存，并在透析结束后转存-70℃冰箱，择日测定。探针在使用前做回收率测定，用于折算透析液中各单胺类神经递质的浓度。

2.3HPLC-ECD分析流动相配置:测定流动相每升含0.15 mol·L-1柠檬酸 -柠檬酸钠缓冲液829 ml;0.1 mol·L-1乙二胺四乙酸二钠1 ml;甲醇150 ml;1-烷基硫酸钠0.283 g。设定流动相流速为0.7 ml·min-1，柱温箱温度为28℃。电化学检测器工作电压为:200 mV、400 mV、600 mV，分别为 2、3、4通道;增益为2 nA。进样量为25 μl。标准曲线用0.025、0.05、0.1、0.2、0.5 mg·L-1的梯度含混合标准溶液绘制。

2.4统计学处理实验数据以±s表示，采用SPSS 13.0统计软件做重复测量数据的方差分析。

3 结果

Fig 1～6描绘了大鼠纹状体细胞外液中NE、DA、DOPAC、HIAA、HVA和5-HT水平的变化情况。从图中可以看出，脑缺血后，纹状体细胞外液单胺类神经递质存在代谢紊乱，各递质含量均有所升高，在一定范围内，随缺血时间的延长而升高的更加明显。在缺血90 min时，纹状体细胞外液DA、NE浓度可达对照组水平的3倍之多。对照组的 NE、DA、DOPAC、HIAA、HVA和5-HT水平由高渐低，其原因可能与结扎其左侧颈总动脉后，左脑暂时性缺血及插入探针时产生的损伤有关。从变化的曲线上看，ECH与 CXQ均可降低脑缺血后 DA、DOPAC、HIAA、HVA和5-HT的达峰浓度，CXQ与高剂量的ECH较为明显。各递质时程曲线下移说明ECH可抑制脑缺血大鼠脑内神经递质及其代谢产物的升高。

Fig 1 Effect of ECH on extracellular level of NE in striatum of rats

Fig 2 Effect of ECH on extracellular level of DA in striatum of rats

4 讨论

脑缺血引起的脑损伤机制较为复杂。在脑缺血情况下，脑内单胺类神经递质发生紊乱，NE、DA、5-HT含量明显降低，脑缺血越重，脑组织NE、DA、5-HT含量就越低［13］。而脑内微透析法证明，脑缺血时单胺类神经递质含量在细胞外液中升高，持续整个缺血期，且随着缺血时间延长而进一步上升，实验结果与报道一致［14］。ECH是从新疆特色植物药管花肉苁蓉中分离、纯化的一种苯乙醇苷类有效成分。其具有抗衰老、改善学习记忆、抗神经元凋亡等多种神经保护作用。本研究采用国内较先进的脑微透析联用HPLC-ECD检测技术，初步探讨ECH对各脑缺血实验大鼠纹状体细胞外液中单胺类递质及其代谢产物的影响，结果表明，ECH可降低由脑缺血所致的纹状体细胞外液中单胺类神经递质的升高作用，具有较好的改善脑缺血组织的损伤作用。

Fig 3 Effect of ECH on extracellular level of DOPAC in striatum of rats

Fig 4 Effect of ECH on extracellular level of HIVV in striatum of rats

Fig 5 Effect of ECH on extracellular level of HVA in striatum of rats

Fig 6 Effect of ECH on extracellular level of 5-HT in striatum of rats

本实验研究结果发现，模型所致的脑缺血损伤可使细胞外液中DA、NE和5-HT的含量升高，变化的幅度与缺血的时间和程度呈正相关。与此同时，其酸性代谢产物DOPAC，HVA，HIAA也随之升高。这是由于脑缺血时，脑组织供血供氧减少，细胞内能量耗竭，神经递质再摄取受到抑制;另一方面单胺氧化酶活性下降，递质降解减少，二者致使单胺类递质及代谢物蓄积在细胞外，进而产生脑缺血性神经损害作用。在ECH和CXQ作用下，脑缺血大鼠纹状体细胞外液中DA、5-HT、HVA、HIAA及 DOPAC水平均明显下降，此可能是由于ECH和CXQ抑制了缺血期DA、和5-HT的过量释放，减轻了DA、和5-HT合成、存储和再摄取的代谢障碍，进而起到了脑神经保护作用。我们的实验从ECH对脑内单胺类神经递质影响，初步探讨ECH抗脑缺血的作用机制，为临床应用和深入的科学研究奠定了新的理论依据。

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