窄谱中波紫外线对银屑病皮损VEGF、bFGF表达及微血管密度水平的影响

杨海龙 ，栗玉珍 ，孙瑞 ，赵晓冬

（1.大庆市人民医院，大庆 163316；2.哈尔滨医科大学附属第二医院，哈尔滨 150086）

银屑病是一种常见、易复发、难以根治的炎症性皮肤病,近年来国内外利用窄谱中波紫外线（NB UVB，波长311～313 nm）照射治疗寻常性银屑病，取得了良好效果，且方法简单，无明显毒副作用，临床应用也日渐增多。但其作用机制非常复杂。目前较肯定的认识是:诱导T细胞凋亡;抑制朗格汉斯细胞等抗原呈递细胞的活性，减少表皮的炎症反应[1，2]。银屑病皮损处最先发生的病理改变是血管的分布和形成的异常[3]。作为一种与血管生成相关的疾病，对银屑病的血管新生机制的研究现已成热点，为了观察NB-UVB方法在治疗本病中的抗血管新生的作用如何，我们对2009年10月—2010年6月于我科就诊的银屑病患者28例用免疫组化法检测银屑病患者皮损中VEGF、bFGF的表达及微血管密度（MVD）值，并观察NB-UVB治疗前后的变化。同时采取正常人组进行对照比较，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 寻常性进行期银屑病患者28例，来自于2009年10月—2010年6月在我院皮肤科门诊及住院患者，其中男15例，女13例；年龄范围15～65岁，平均42.1岁；病程6个月～20年，平均4.2年；皮损面积15%～40%。并且符合以下标准：①2周内未使用糖皮质激素、维A酸类药物局部治疗者；②8周内未系统使用糖皮质激素、免疫抑制剂者；③无其他系统性疾病及免疫功能缺陷者，皮损经组织病理检查证实具有寻常性银屑病的组织病理改变。征得患者本人同意，并签署知情同意书。

15例对照组正常人皮肤来自我院整形美容科门诊手术室，其中游离植皮修复术6例（取腹部4例，下肢2例），下睑松弛整形术4例，面部除皱术5例，入选者均排除全身系统性疾病。

1.2 主要试剂 抗VEGF（兔抗人单克隆抗体，工作液），抗CD34（鼠抗人单克隆抗体，工作液），免疫组化通用型两步法检测试剂盒PV6000，以上三种试剂购自北京中杉生物技术有限公司，抗bFGF（兔抗人多克隆抗体，1∶200），试剂购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 NB-UVB治疗 使用WaldmannUVB100L光疗仪（德国沃德曼公司辐射强度为9.13mW/cm2，峰值311nm）全身照射，初始剂量根据患者的皮肤类型定在0.5～0.7J/cm2之间，以后增加固定剂量0.1J/cm2，2～3 次/周，累计最大剂量为 2.0J/cm2，或至95%的皮损消退后稳定剂量，以后逐渐延长每次照射的间隔时间，共20次。

1.3.2 标本处理 病例组分别于光疗前后活检取材0.6cm×1.0cm大小皮损，躯干15例，上肢5例，下肢8例。所有标本经固定、包埋后，3μm切片，备免疫组化染色用。

1.3.3 免疫组化两步法（PicTureTM） VEGF、bFGF一抗用0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）进行高压热修复，CD34一抗采用微波热修复。3%H2O2去离子水避光室温孵育20min，灭活内源性过氧化物酶，滴加一抗，37℃恒温箱湿盒内孵育60min，滴加通用型IgG抗体（Fab段）-HRP多聚体，室温或37℃孵育30min，DAB（二氨基联苯胺）显色。苏木精复染，脱水，透明，封片后摄片。PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。

1.3.4 结果判断 VEGF和bFGF：细胞有棕黄色颗粒视为染色阳性。采用半定量计分法判定。按着色程度评分，无着色=0，浅黄色=1，棕黄色=2，棕褐色=3。按阳性细胞所占比例评分，<20%=0，20%～50%=1，50%～80%=2，>80%=3。按以上2项指标的积分和分为 4 级，(-)为 0～1 分，(+)为 2 分，(++)为 3～4 分，(+++)为5～6分。CD34与MVD计数：CD34定位于血管内皮细胞胞膜和胞浆，阳性者被染成棕色。MVD的测定参考Weidner[4]方法进行，即先在低倍镜（×100）下扫视整片，寻找高密度血管区，确定微血管最密集的3个视野，然后在高倍镜（×400）下计数每一个视野下的微血管数目。取3个视野计数结果的均数为该切片的微血管密度值。

1.4 统计学方法 数据采用SPSS15.0/PC软件进行统计分析，VEGF、bFGF结果采用等级资料比较的秩和检验，CD34采用小样本t检验，以P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 PASI评分 银屑病患者经过20次NB-UVB治疗，PASI评分明显下降(t=6.18，P<0.01)，见表 1。

2.2 免疫组化结果 银屑病患者治疗前的MVD明显高于正常对照组（t=7.32，P<0.01），见表 1；银屑病患者治疗后的MVD明显低于治疗前（t=3.92，P<0.01），见表1及图1、图2。银屑病患者治疗前VEGF、bFGF的表达明显高于正常对照组（U=28；U=36，P均<0.01），见表2；银屑病患者治疗后的VEGF、bFGF的表达明显低于治疗前（U=103；U=97，P均<0.01），见表2及图3～6。

表1 银屑病患者治疗前后及正常人PASI评分、皮损中MVD 值（±s）

表1 银屑病患者治疗前后及正常人PASI评分、皮损中MVD 值（±s）

例数15 28 28 MVD 3.09±1.13 25.18±9.60 7.42±3.93组别正常对照组银屑病组（治疗前）银屑病组（治疗后）PASI评分0.00 19.23±8.12 3.22±4.17

表2 银屑病患者治疗前后皮损处及正常人VEGF、bFGF的表达 例

3 讨论

新生血管形成是银屑病的主要病理特征之一。银屑病皮损处真皮乳头层血管增生，数量增多，微血管扩张迂曲、通透性增加，这种新生血管的形成和分布的改变是银屑病中最早发生的病理变化。我们对银屑病患者皮损和正常对照组皮肤的MVD测定结果与之相符。已有研究显示，许多促血管新生因子的mRNA和蛋白质水平在银屑病皮损中升高。在这些调节因子中，血管内皮生长因子 (vascular endothelialgrowth factor，VEGF)是引起血管通透性增加和血管内皮细胞增殖、迁移及诱导血管生成的一种主要调节因子[5]。VEGF主要由角质形成细胞分泌，是一种内皮细胞特异性有丝分裂原，它与激酶插入嵌合体(kinaseinsert domaincontaining receptor，KDR)结合后刺激内皮细胞增殖，而与血管内皮细胞上的特异性受体Flt-1结合后参与血管分化和生成。VEGF还可提高血管通透性，主要是增加毛细血管后静脉、小静脉的通透性，是已知的最强烈的血管通透因子。它具有诱导内皮细胞表达纤溶酶原激活物及抑制物，维持血管分裂压力，促进不同来源的内皮细胞分裂增殖和血管扩建的作用[6]，同时血清中VEGF的高表达也是导致新生血管形成的部分原因。有研究发现银屑病患者皮损和血清内VEGF显著高于正常人群[7]，这一点同样与我们的测定结果相符。因此VEGF是与银屑病发生、进展以及长期反复发作相关的重要因素。

图1 银屑病治疗前皮损处CD34的表达（免疫组化染色×200）

图2 银屑病治疗后皮损处CD34的表达（免疫组化染色×200）

图3 银屑病治疗前皮损处VEGF的表达（免疫组化染色×200）

图4 银屑病治疗后皮损处VEGF的表达（免疫组化染色×200）

图5 银屑病治疗前皮损处bFGF的表达（免疫组化染色×200）

图6 银屑病治疗后皮损处bFGF的表达（免疫组化染色×200）

bFGF是一种能促进细胞增殖和血管生成的多功能细胞因子，现已证明其在体内外对内皮细胞有促分裂和趋化作用，能刺激内皮细胞产生胶原酶和纤维蛋白酶，降解基底膜，并诱导毛细血管内皮细胞向三维胶原基质中迁移，形成毛细血管样腔状结构[8，9]，在许多皮肤病，包括表皮肿瘤、脂溢性角化病、基底细胞上皮瘤和鳞状细胞癌中，bFGF常呈过度表达，参与促进瘤细胞增殖和血管生成的病理过程，且试验中还发现bFGF对VEGF的表达具有调控作用[10]，而在我们先前的研究中也已发现，银屑病患者皮损处二者存在相关性高表达关系，提示bFGF可能是通过上调VEGF及其受体的表达而间接促进了血管生成，这说明VEGF与bFGF在银屑病中促血管生成方面能起一定的协同作用。

我们的研究显示，NB-UVB照射能明显减少银屑病患者皮损处真皮微血管的数量和皮损处VEGF、bFGF的表达水平。NB-UVB可能降低了患者皮损中角质形成细胞对VEGF、bFGF的表达，从而导致银屑病皮损中新生血管减少进而达到治疗目的。因此，通过降低角质形成细胞促血管新生因子的水平来间接发挥抗血管新生作用也可能是NBUVB治疗银屑病的机制之一。

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