黄芩苷对HaCaT细胞影响的蛋白组学研究

张珍 ，闵 玮 ，林秉奖 ，骆 丹

（1.南京医科大学第一附属医院，南京 210029；2.苏州大学第一附属医院，苏州 215006；3.宁波市第一人民医院，宁波 315000）

近年来发现黄芩苷具有抗菌、抗病毒、抗感染、抗氧化及清除氧自由基和抗肿瘤等药理作用。本研究小组的先期实验已证实，黄芩苷处理可以有效减轻皮肤细胞光损伤，减少细胞凋亡率和抑制炎症介质分泌[1]。但黄芩苷对生理状态下皮肤细胞的影响，尤其是其作用机制的认识目前还欠深入。本实验应用蛋白质组学双向凝胶电泳和质谱技术研究黄芩苷对人表皮角质形成细胞HaCaT株差异表达蛋白的影响，以进一步阐明黄芩苷具有的生物学活性和对皮肤细胞的保护效应机制。

1 材料和方法

1.1 主要仪器和试剂 丙烯酰胺(acrylamide)、甲叉双丙烯酰胺(N,N’-Methylenebisacrylamide)、四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸胺（APS）、固相 PH 梯度（immobilized PH gradient）胶条（24cm PH3～10NL）、三羟甲基氨基甲烷 (Tris)、超纯尿素、二硫苏糖醇(DTT)、3-[(3-胆酰胺醛)-二乙胺]-丙磺酸（CHAPS）、碘乙酰胺（IAA）、低熔点琼脂糖均为瑞典Amersham公司产品；十二烷基磺酸钠(SDS)、序列修饰后胰蛋白酶（modified trypsin）为美国Promega公司产品；蛋白酶抑制剂cocktail、中低分子量标准蛋白质（118、85、47、36、26KDa）、乙晴（CAN）、三氟乙酸（TFA）均为美国Sigma公司产品；黄芩苷购自中国药品生物制品检定所。其余试剂均为国产分析纯。

IPGphor聚焦系统、Ettan DaltⅡ垂直电泳系统、ImageScanner TM扫描仪、ImageMaster凝胶分析软件、SDS-PAGE灌胶装置均为瑞典Amesham公司产品；MALDI-MS质谱仪BIFLEXⅣ为德国Bruker公司产品；低温超高速离心机为德国Beckman公司；细胞超声破碎仪为美国SONICS公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 在37℃、5%CO2条件下将永生化角质形成细胞系HaCaT细胞培养于细胞培养箱中。80%融合时，以0.25%胰酶消化，用含10%小牛血清的1640培养基调整其浓度为1×106/mL，定量接种于10cm培养皿中，继续培养。实验分为对照组、黄芩甘孵育组。黄芩甘孵育组以终浓度200μg/mL黄芩苷孵育HaCaT细胞并培养48h。

1.2.2 细胞总蛋白抽提 按每1.5×106个细胞加入细胞裂解夜50μl/L的比例加入裂解夜，冰水浴中进行超声（150w，超声 3s，间隔 30s，共5次），超声结束后裂解夜转为澄清。室温放置1h，其间每隔15min涡旋一次×3s。4℃，40000g离心 1h，收集上清，40μl/L管分装，Bradford法定量蛋白，－80℃保存备用。

1.2.3 蛋白质双向凝胶电泳

1.2.3.1 固相梯度等电聚焦电泳及平衡 选取24cm的IPG胶条，银染上样量为90μg。第一向等电聚焦按如下程序自动进行：①低电压水化，30v 6h；60v 6h；②升压，500v 1h step；1 000v 1h step；③等电聚焦，8 000v step约10h。待24cm胶条等电聚焦达到80 000vhr，13cm胶条等电聚焦达到30 000vhr时，第一向等电聚焦结束。电泳完毕后，从胶条槽中取出胶条，胶条平衡缓冲液Ⅰ10mL轻微振荡平衡15min，再换胶条平衡缓冲液Ⅱ10mL轻微振荡15min。SDS电泳缓冲液中清洗，滤纸吸干多余水分。

1.2.3.2 SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳 配制浓度为12.5%的均一的SDS聚丙烯酰胺分离凝胶，将已经平衡好的IPG胶条置于第二向凝胶顶端，用低熔点琼脂糖封胶液封胶条，排尽胶条与凝胶面之间的气泡。上Marker，待低熔点琼脂糖封胶液凝固后，将凝胶转移入垂直电泳槽。用Ettan-DaltⅡ垂直电泳仪进行电泳，24cm胶条参数设置为P1 2w/胶，1h；P2 5w/胶30min；P3 15w/胶10h。在溴酚兰前缘运行到凝胶底部边缘时，终止电泳。24cm胶条一般垂直电泳运行时间为7h。银染后显色，终止10min后以去离子水洗10min×2次，保存待用。

1.2.3.3 图象采集及图谱分析 染色后的双向电泳凝胶用ImageScanner TM扫描仪进行透射扫描，数字化图象文件运用Amersham Pharmacia公司的ImageMasterR 2DElite(Version 2.00)软件分析。

1.2.4 质谱分析 使用蛋白质点酶切法：去离子水洗胶，用直径1.5mm枪头从枪上取点，尽可能将目的点取完整；质谱样品点样：将样品和基质按1∶1等体积混合后吸取1μL点样于点样靶上，干燥晾干；肽质量指纹图谱的检测：在延迟解吸和反射模式下进行谱图采集，激光波长337nm，加速电压设置19KV。每一个肽谱图大约是由200次轰击垒加而成，外标采用布鲁克公司肽混合物标准品，内标采用胰蛋白酶的自切峰，分别为m/z 842.50和m/z 2211.10。洗靶：检测结束后，用0.1%TFA洗靶30s～1min后吸弃。

1.2.5 数据库查询 用Mascot搜索引擎（http://www.matrixscience.com//mascot/cgi/search_form.pl?FORMVER=2&SEARCH=PMF）进行数据库的检索。检索条件：蛋白质数据库选择SwissProt库，物种来源选择人，酶选择Trypsin，允许不完全的酶解片段选择为1个，肽片段分子量最大允许误差为50ppm，离子选择为MH+。

2 结果

2.1 黄芩苷孵育前后HaCaT细胞的双向凝胶电泳结果 收集黄芩苷孵育前、后HaCaT细胞进行双向凝胶电泳，实验重复3次，得到的银染图谱如图1所示。

图1 黄芩苷孵育前后HaCaT细胞双向电泳凝胶图谱(银染)

2.2 黄芩苷对2-DE图谱中差异蛋白质点的影响及肽质量指纹谱鉴定 在培养的HaCaT细胞中加入黄芩苷孵育后，与对照组相比共筛选出38个差异蛋白质点。从中随机抽取部分（18个）蛋白点进行肽质量指纹谱鉴定。其中1个点（spot1703）仅在对照组HaCaT细胞中表达，另2个点（spot 1805、2151）仅在经黄芩苷孵育的HaCaT细胞中表达；10 个 点 （spot 1242、1396、1421、1458、1511、1573、1858、1914、2336、2410） 经黄芩苷孵育后在 HaCaT细胞中高表达，5 个点（spot502、3253、3334、3335、3967）在黄芩苷孵育后的HaCaT细胞中低表达。经搜索Swiss Prot蛋白数据库综合分析，并去除未知蛋白，在18个差异蛋白点中共成功鉴定14个蛋白点，具体数据库查询结果见表1。

表1 差异蛋白质点质谱分析结果

3 讨论

现代药理实验证实黄芩苷有抗变态、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、清除自由基等药理作用。此外，黄芩苷还具有较强的抗癌作用，抑制肿瘤细胞增殖、分化，诱导其凋亡和抑制血管生成。我们的前期研究证实黄芩苷可抑制急性光损伤皮肤细胞如角质形成细胞（KC）和成纤维细胞（FB）中光产物的产生，加速DNA损伤修复，提示黄芩苷在阻止皮肤光源性损伤进程中有重要作用[2]。但是关于黄芩苷对生理状态皮肤细胞的影响方面目前还少有研究。本实验中我们使用终浓度为200μg/mL的黄芩苷与HaCaT细胞共孵育，并利用蛋白质组学技术检测黄芩苷对细胞蛋白表达水平的影响。结果共筛选出38个差异蛋白质点，选取其中18个差异蛋白质点，进行质谱分析，获得15个点的肽质量指纹图谱，初步鉴定为热休克蛋白beta-1、肌动蛋白、二氢嘧啶酶调节蛋白2等。

受黄芩苷作用而下调的蛋白主要是二氢嘧啶酶相关蛋白-2(dihydropyrimidinase-related protein 2,Dpysl2)和核纤层蛋白C（lamin C），它们都属于细胞骨架蛋白。Dpysl2通过与微管蛋白异二聚体结合促进微管形成。Lamin参与形成贯穿于细胞核与细胞质的骨架结构体系，还参与DNA的复制、转录和损伤修复、维持染色体结构与基因组稳定性等[3]。细胞骨架通过有序的解聚和重排为细胞运动提供动力。恶性肿瘤细胞常表现出运动和迁移能力增加，对于细胞骨架的抑制能力是很多抗肿瘤药物的治疗靶点。本研究中，黄芩苷可以明显抑制生理状态的培养HaCaT细胞中Dpysl2和Lamin C两种细胞骨架蛋白表达水平，表明黄芩苷有可能通过作用于细胞骨架而降低细胞的运动能力。这可能是黄芩苷抗肿瘤生物活性的机制之一。

热休克蛋白27(heatshock protein 27,HSP27)在黄芩苷共孵育时表达上调。HSP27可保护细胞抵抗各种刺激引起的细胞凋亡，HSP27在应激状态下表达增高，可提高细胞的抗氧化应激能力[4]。此外，HSP27还参与调节细胞的增殖、分化等。本研究中发现黄芩苷可在生理状态的HaCaT细胞中引起HSP27表达增高，表明黄芩苷可有效提高皮肤细胞抗应激损伤的防御能力，这对保护细胞抵抗各种环境刺激因素，包括紫外线辐射损伤方面具有积极意义。

黄芩苷还可上调HaCaT细胞中26S蛋白酶体调节亚基 7（26Sprotease regulatory subunit7）和蛋白酶体激活因子亚基2(proteasome activator subunit2)的表达水平。它们均与26S蛋白酶体活性密切相关，后者是泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)的重要组成部分。UPP可高效并高选择性地降解细胞内蛋白质，参与细胞多种生理活动过程，如细胞凋亡、MHCⅠ类抗原的递呈、细胞周期以及细胞内信号传导等，对维持细胞的稳态和正常的生理功能具有十分重要的意义。因此黄芩苷上调HaCaT细胞中26S蛋白酶体调节亚基7和蛋白酶体激活因子亚基2的表达水平，将有助于增强细胞内环境的稳定，提高对突变和环境刺激损伤的监控与防御能力。

黄芩苷还可以调高另外两个细胞骨架蛋白，原肌球蛋白(tropomyosin,TM)异构体和肌动蛋白(actin)的表达水平。Actin参与细胞的转移、分裂和原质的流动，动物胞囊和器官的运动，细胞间信息的传递，以及细胞的形状和连结的建立和维持等[5]。TM在细胞移动、形态发生和胞浆移动中调节肌动蛋白丝的动态变化。黄芩苷对TM和Actin的促表达作用可能有助于增强细胞形态及内环境的稳定。

综上所述，黄芩苷可通过上调HSP27等多种蛋白的表达，增强细胞的稳态和抵抗环境刺激损伤的能力，同时黄芩苷可能通过影响Lamin C等细胞骨架蛋白而发挥抗肿瘤活性。这些结果有助于我们加深对黄芩苷生理活性和对皮肤细胞影响的理解，为黄芩苷在皮肤科领域的应用奠定基础。

［1］ 闵玮，骆丹，林向飞.黄芩苷对皮肤细胞紫外线辐射损伤的保护作用[J].徐州医学院学报，2004，24（2）：167-170.

［2］ Bing-Rong Z,Song-Liang J,Xiao-EC,etal.Protectiveeffectof the Baicalin againstDNA damage induced by ultravioletB irradiation to mouse epidermis[J].Photodermatol Photoimmunol Photomed,2008,24:175-182.

［3］ Harper M,Tillit J,Kress M,et al.Phosphorylation-dependent binding of human transcription factorMOK2 to lamin A/C[J].FEBS J,2009,276:3137-3147.

［4］ Kazmierczuk A,Kiliańska ZM.Role of heat shock proteins in cell apoptosis[J].Postepy HigMed Dosw(Online),2010,64:273-283.

［5］ Chen Z,Borek D,Padrick SB,et al.Structure and control of the actin regulatoryWAVE complex[J].Nature,2010,468:533-538.