木姜叶柯总黄酮的质量控制方法研究

蒋珍藕， 邱宏聪， 韦宝伟， 李 茂， 陆国寿

(广西中医药研究院，广西南宁 530022)

木姜叶柯总黄酮是木姜叶柯的干燥嫩叶经提取分离纯化的有效部位。木姜叶柯为壳斗科柯属植物Lithocarpus litseifolius(Hance)Chun.［1］的干燥嫩叶，具有清热解毒，化痰，祛风，降压的作用，主治湿热泻痢，肺热咳嗽，痈疽疮疡，皮肤瘙痒，高血压［2］;现代研究表明，木姜叶柯中的黄酮类成分具有降血糖，降血压，降脂及抗过敏，抗炎等作用，尤其根皮苷在糖尿病及其并发症的防治中具有独特的效果［3］，木姜叶柯将可能是一种新型的预防和治疗糖尿病的新药材。为了有效地控制木姜叶柯总黄酮的质量，本实验对木姜叶柯有效部位总黄酮的质量控制方法进行了研究。

1 仪器、试药与材料

LC－20A高效液相色谱仪、SPD－20A紫外检测器(日本岛津公司)，威玛通用多媒体色谱数据工作站;UV2550紫外分光光度计(日本岛津公司)、B2200S超声清洗机(上海必能信超声有限公司)、LIBROR AEL－200电子天平(日本岛津公司)。

根皮苷对照品:购买于 SIGMA公司，批号为083K7072，经高效液相色谱归一化法测定纯度在98%以上。乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。薄层层析硅胶 G:化学纯，批号00081107，青岛海洋化工有限公司。

5批木姜叶柯总黄酮由本课题组提取制备，分别编号为 1#、2#、3#、4#、5#，其中 1#～2#为小试样品、3#～5#为放大验证试制样品。用于制备总黄酮的木姜叶柯药材采自广西苹果县海城乡荣芳村陆拥屯，经广西中医药研究院中药资源所覃德海副研究员及饶伟源副研究员鉴定为壳斗科柯属植物木姜叶柯Lithocarpus litseifolius(Hance)Chun.的干燥嫩叶。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

取本品细粉0.1 g，加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取根皮苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的对照品溶液。再取木姜叶柯对照药材0.5 g，加甲醇10 mL超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为对照药材溶液。吸取上述三种溶液各2～5 μL，点于同一含0.4%乙酸钠的以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯－2－丁酮－甲醇－水(10 ∶5 ∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铝乙醇溶液，热风吹数分钟，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，有相同颜色的荧光斑点。经多批样品试验，可作为木姜叶柯总黄酮的定性鉴别方法。

2.2 根皮苷的测定方法研究

参照文献［4－5］并经试验调整，采用高效液相色谱法对木姜叶柯总黄酮中的主要有效成分根皮苷进行测定。

2.2.1 实验条件的选择

2.2.1.1 色谱条件:Thermo HYPERSIL ODS－2(250 mm ×4.6 mm，5 μm)色谱柱;流动相:乙腈－0.1% 磷酸(21∶79);检测波长:280 nm;柱温:室温;进样量为5 μL。理论板数按根皮苷峰计算，应不低于2 000。在上述色谱条件下，供试品中根皮苷与其它杂质达到基线分离，分离度大于1.5，可满足定量要求。另吸取甲醇溶剂，注入高效液相色谱仪进行空白试验，结果在根皮苷出峰处不出现色谱峰，表明溶剂对根皮苷测定不产生干扰。见图1。

图1 高效液相色谱图

2.2.1.2 对照品溶液的制备:取根皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含100 μg的溶液，即得。

2.2.1.3 供试品溶液的制备:取本品细粉20 mg，精密称定，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声处理(功率80 W，频率50 kHz)10 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 方法学考察及样品的测定

2.2.2.1 线性关系考察:精密称取根皮苷对照品10.5 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取 0.5、1、2、5、10 mL，分别置 10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别作为对照品溶液，按上述色谱条件分别进样5 μL测定。以根皮苷对照品进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积值为纵坐标(Y)绘制标准曲线，得回归方程为:Y=2 067 966X－22 031.903 7(r=0.999 9)，线性范围:0.105 ～2.100 μg。

2.2.2.2 精密度试验:对同一供试品溶液(1批)，连续测定5次，记录根皮苷峰面积。结果RSD为1.67%(n=5)。试验表明，精密度良好。

2.2.2.3 稳定性试验:对同一供试品溶液(1批)，于0、1、2、4、10、12 h 依法测定，记录根皮苷峰面积，结果RSD为1.73%(n=6)。试验表明，在12 h内被测物稳定。

2.2.2.4 重复性试验:对同一批样品(1 批)，平行测定6份，计算根皮苷质量分数。结果平均质量分数为 299.40 mg/g，RSD 为 1.96%(n=6)。结果表明，重复性较好。

2.2.2.5 加样回收率测定:精密称取根皮苷对照品33.0 mg，置500 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取重复性试验项下的木姜叶柯总黄酮样品约10 mg，平行取6份，精密称定，分别精密加入上述根皮苷对照品溶液50 mL，按上述拟订的方法提取、测定，计算回收率，结果平均加样回收率为 98.74%，RSD 为 1.70%(n=6)，符合定量分析的要求，详见表1。

表1 根皮苷回收率测定结果(n=6)

2.2.2.6 样品测定:取第3、4、5 批木姜叶柯总黄酮样品20 mg，各3份，精密称定，依法制成供试品溶液，依法测定根皮苷。结果见表2。

表2 根皮苷测定结果(n=3)

2.3 总黄酮测定方法研究

2.3.1 实验条件

2.3.1.1 对照品溶液的制备:取根皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含15 μg的溶液，即得。

2.3.1.2 供试品溶液的制备:取本品细粉20 mg，精密称定，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声处理(功率80 W，频率50 kHz)10 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液0.5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.1.3 测定波长的选择:吸取根皮苷对照品溶液及供试品溶液各适量，以甲醇做空白对照，在紫外分光光度计200～400 nm波长下扫描，结果根皮苷对照品及供试品均在280 nm波长处有最大吸收，故选择280 nm作为测定波长。

2.3.2 方法学考察及样品的测定

2.3.2.1 线性关系考察:精密称取根皮苷对照品13.01 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取10 mL置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取 0.5、1、2、5、7 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别作为对照品溶液，于280 nm处测定吸光度(A值)。以根皮苷浓度(μg/mL)为横坐标(X)，A值为纵坐标(Y)绘制标准曲线，得回归方程为:Y=0.0399X－0.0007(r=0.999 9)，线性范围:2.602 ～ 36.428 μg/mL。

2.3.2.2 精密度试验:对同一份供试品溶液(2批)，连续测定6次吸光度，结果RSD为0.38%(n=6)。结果表明，精密度良好。

2.3.2.3 稳定性试验:对同一供试品溶液(2批)，于0、1、2、4、8、12 h 依法测定吸光度，结果 RSD 为0.69%(n=6)。结果表明，在12 h内测定保持稳定。

2.3.2.4 重复性试验:对同一批样品(2 批)，平行测定6份样品的总黄酮，结果平均质量分数为70.67%，RSD 为1.65%(n=6)。结果表明，重复性较好。

2.3.2.5 加样回收率测定:取重复性试验项下的木姜叶柯总黄酮样品约10 mg，平行取6份，精密称定，分别精密加入根皮苷对照品7 mg，按上述拟订的方法提取、测定，计算回收率，结果平均回收率为101.49%，RSD 为 1.37%(n=6)，符合定量分析的要求，详见表3。

表3 回收率测定结果

2.3.2.6 样品测定:精密称取 3、4、5 批木姜叶柯总黄酮样品20 mg，各3份，依法制成供试品溶液，依法测定，计算结果见表4。

表4 总黄酮测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 供试品溶液提取时间的选择 分别对超声10、20、30 min的供试品溶液进行测定，结果随着时间的增加，总黄酮增加不明显，说明超声处理10 min已能将被测成分基本提取完全，同时考虑到实验效率和成本，故采用超声处理10 min作为提取时间。

3.2 总黄酮的测定经典的方法是以芦丁为对照品比色测定［6－8］，为此，本实验也曾以芦丁为对照品，通过络合比色法测定木姜叶柯中总黄酮，但针对性不强，测定结果不理想。这可能是由于芦丁属于黄酮醇类化合物(结构为5、7、3′、4′－ 四羟基黄酮 －3 － 芸香糖苷)，木姜叶柯中黄酮成分主要为二氢查耳酮类化合物，与芦丁在结构上差异较大，因此芦丁不适合用于木姜叶柯总黄酮成分测定。之后，本实验选择木姜叶柯中主要成分根皮苷为对照品，采用直接紫外测定法测定总黄酮，结果可靠。

3.3 本实验除了建立薄层色谱定性鉴别外，还采用高效液相色谱法对主要有效成分根皮苷进行测定，同时还采用紫外分光光度法测定总黄酮。因此，本文所建立的质量控制方法能比较全面地、有效地控制木姜叶柯总黄酮质量。

［1］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志:22卷［M］.北京:科学出版社，1998:201.

［2］国家中医药管理局中华本草编委会.中华本草:2卷［M］.上海:上海科学技术出版社，1999:431.

［3］Joel R L，Ehrenkranz，Norman G L，Kahn C R.et al.Phlorizin:a review［J］.Diabetes Metab Res Rev，2005，21:31－38.

［4］陈 磊，杨建荣，黄雪松.高效液相色谱法快速测定红富士苹果渣中的6种多酚［J］.食品与发酵工业，2008，34(8):158－160.

［5］方 荣，杨 茜，李 莉，等.湖北海棠中根皮苷含量测定［J］.食品科技，2008，33(6):195－196.

［6］郑杭生，李计萍，韩 炜，等.紫外－可见分光光度法测定总黄酮含量的方法学考察要点［J］.中成药，2008，30(9):1364－1365.

［7］魏 艳，陈晓青，马志祥，等.红蓼不同提取部位花旗松素和总黄酮含量的测定［J］.中成药，2008，30(12):1853－1855.

［8］杨少军，孟陆亮，靳子明.慈菇消脂丸的质量标准研究和总黄酮含量测定［J］.中成药，2009，31(5):749－753.