慢性复合应激对大鼠学习记忆功能及脑ERK表达活化的影响*

郑 刚，骆文静，陈耀明，刘明朝，马金龙，陈景元

(第四军医大学军事预防医学系劳动与环境卫生学教研室，陕西 西安 710032)

应激对大脑功能的影响是神经科学和心理学领域研究的热点问题。较多的研究证实，当人或动物处于强烈的急性应激或长期慢性应激的状态时，其大脑功能(如学习记忆等)可受到明显的损害[1，2]。目前的研究大多采用单一的应激原进行刺激，如束缚、足电击等。但在实际情况下，应激原通常是复合存在的。有关复合应激原影响大脑学习记忆功能的分子机制的研究目前还较少。在中枢神经系统中，大脑皮质、海马是与学习记忆功能密切相关的重要脑区。本实验建立慢性复合应激大鼠模型，观察应激对大鼠学习记忆功能的影响，以及应激反应过程中海马、前额皮质组织中细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)表达的变化，探讨慢性复合应激对学习记忆功能的影响及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

成年雄性SD大鼠90只，体重 200～250g，由第四军医大学实验动物中心提供。首先将大鼠在动物饲养室中适应1周，室温(23±1)℃，相对湿度50%，自然光照，通风良好，自由进食饮水。将大鼠随机分为对照组(n=18)和应激组(n=72)。

1.2 应激方法

慢性复合应激方法:分别采用低温暴露(-15℃，3 h/d)、噪声(20Hz-20kHz，30min/d)、足电击(45 V ，1 s/pulse，间隔 5 s，30min/d)、束缚(2 h/d)、尾部悬吊(3h/d)、睡眠剥夺(24h/d)、振荡(水平振荡频率120b/min，10min/d)等7种方式，按照上述顺序每天采用一种方法对大鼠进行应激刺激。应激组大鼠平均分为4组 ，每组 18只，分别接受 1、2、3、4 周的应激刺激。

1.3 学习记忆功能观察

Morris水迷宫直径120cm，深40cm，水深25 cm，平台高23 cm，平台直径10cm;水温23℃±2℃，在水中加入适量奶粉使之不透明。将平台置于迷宫某一象限对角线中点处并在整个训练过程中保持不变，连续3 d进行定位航行实验训练。每只大鼠每天连续接受8次训练，方法为将大鼠依次从4个象限，面向池壁放入水中，每次训练搜索时间为60s。大鼠每次找到平台后，使之在平台上停留20s;若超过60s未能找到平台者，由实验者引导其爬上平台并停留20s。上述训练的目的是使大鼠基本掌握水迷宫训练模式及搜索平台的技巧。水迷宫训练结束24h后应激组大鼠开始接受各种应激刺激，第1、2、3、4周最后1天刺激结束后24h重复进行8次定向航行实验。在此期间对照组大鼠不接受任何处理，与应激组大鼠同步进行定向航行实验。所有大鼠每次训练找到平台的潜伏期由摄像装置拍摄并传输到计算机保存、分析。

1.4 激素水平检测

分别于1、2、3、4 周应激结束后，断头处死未进行水迷宫训练的应激组和对照组大鼠各8只，取血，室温下放置4h，3000r/min离心 15 min，取上清液(血清)，按照放射免疫分析试剂盒的说明书检测皮质酮(corticosterone，CORT)的水平。

1.5 免疫印迹法(Western blot)检测ERK1/2的磷酸化水平

1.5.1 组织样品处理 断头处死大鼠后，每组随机选取3只取全脑，按照大鼠神经解剖图谱分离海马、前额皮质等脑区组织。分别称取上述脑区组织各50mg于玻璃匀浆器中，加入500μl组织细胞裂解液(含50mmol/L Tris-HCl，pH 7.4;300mmol/L NaCl;10ml/L乙基苯基聚己二醇(Nonidet P-40);1 g/L SDS，1 mmol/L EDTA;1mmol/L Na3VO4，100mg/L苯甲基磺酰氟(PMSF);蛋白酶抑制剂(cocktail))，匀浆，冰水浴约 20min，4℃、12000r/min离心 15 min，取少量上清液，采用考马斯亮蓝法定量分析样品中的总蛋白含量。其余上清液加入等量 2×SDS Sample Buffer，煮沸 5 min，保存于-80℃。

1.5.2 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western blot检测ERK1/2的磷酸化水平 配制5%的积层胶和12%的分离胶;根据蛋白定量分析结果，调整各泳道样品中蛋白总量一致。电泳80V/20min，120V/80min结束，250mA/90min将凝胶中蛋白转移至NC膜;以封闭液(25mmol/L TBS溶液，50g/L脱脂奶粉，1 ml/L吐温-20)室温封闭 1 h。加一抗，于 4℃过夜;洗膜;加相应二抗，37℃孵育 1.5 h;洗膜。滴加化学荧光试剂(美国Pierce公司)，在暗室中用X光胶片(Kodak)压片成像。凝胶成像分析仪(美国SYNGENE公司)扫描各免疫印迹条带灰度值并进行分析。所使用抗体及稀释浓度:p-ERK(鼠单抗，1:1000稀释)，ERK1(兔多抗，1:3000稀释)，二抗(羊抗鼠，1:2000稀释;羊抗兔，1:6000稀释);以上抗体均购于美国Santa Cruz公司。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 慢性复合应激对大鼠学习记忆能力的影响

大鼠Morris水迷宫定位航行在接受慢性复合应激以后第1周和第2周，找到隐藏平台的潜伏期显著延长(P＜0.05);第3周时虽然应激组大鼠潜伏期绝对值略有延长，但两者无显著性差异(P＞0.05);而第4周时应激组大鼠潜伏期比对照组显著延长(P＜0.05，图1)。上述结果提示慢性复合应激损害大鼠的学习记忆功能，但是在第3周时有一短时间的恢复。

Fig.1 Effects of chronic stress on learning andmemory of rats in the Morris water maze test(，n=10)

2.2 慢性复合应激对大鼠血清糖皮质激素水平的影响

慢性应激后，大鼠血清中CORT水平升高，1周和2周时均显著高于对照组水平;3周时CORT水平有一定回落，与对照组水平无显著性差异(P＞0.05);而4周时则再次升高，且显著高于对照组水平(图2)。

Fig.2 Effects of chronic stress on the serum CORT level of the rats(，n=8)

2.3 慢性复合应激后不同脑区ERK1/2表达活化水平的改变

慢性复合应激后，大鼠海马P-ERK1/2水平在1周和2周时显著降低(P＜0.05)，3周时水平有所恢复，与对照组水平无显著性差异，而4周时P-ERK1/2水平又再次低于对照组水平。前额皮质P-ERK1/2水平在慢性复合应激后的变化与海马基本一致，也呈降低-增高-降低的趋势。而各时间点总ERK1/2水平无显著变化(图3)。

3 讨论

应激可以对学习记忆功能产生复杂的影响。近年来大量研究表明，应激反应可以对大脑功能(如学习记忆等)产生损害[2]，然而也有研究发现在某些情况下适度的应激刺激可以有助于提高动物的学习记忆能力[3]。为了探讨较长时间的应激刺激对学习记忆功能的影响及其机制，在本实验中我们通过Morris水迷宫实验观察慢性复合性应激后不同时间点大鼠学习记忆能力的改变。结果显示:慢性复合应激后大鼠的学习记忆能力显著下降;而3周时大鼠的学习记忆功能有所恢复。一般认为:应激反应可以分为3期，即(1)警觉期，是机体对应激的初步反应，表现为心率加快、血压升高、骨骼肌的血流量增加等，动用机体的防卫机制以克服应激。(2)抵抗期，此期是机体内部防御力量处于高水平的状态，机体与应激原对峙的结果有两种:一是机体战胜了应激原，内环境重建稳定;二是应激原持续存在，机体受到损害而进入衰竭期。(3)衰竭期，出现病理性应激表现，内环境紊乱和全身适应综合征。本实验结果提示，慢性复合性应激可以损害大鼠的学习记忆能力，3周时学习记忆功能的恢复可能是在较长时间的应激反应中，大鼠自身的防御力量逐渐与应激刺激达到一种平衡关系;但是应激时间达到4周时，大鼠的学习记忆能力再次严重下降，这种现象可能是由于大鼠对应激做出的自身调整在3周时达到了一种与应激负荷之间的暂时性平衡，而应激刺激继续作用将可能打破这种平衡关系，从而损害大脑功能。

Fig.3 Effects of chronic stress on P-ERK levels in the hippocampus and prefrontal cortex of the rats(，n=4)

应激的主要非特异性反应之一是下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamus-pituitary-adrenal axis，HPA)轴的激活，从而引起全身性代谢效应、生理变化乃至行为改变和疾病发生。在应激状态下，CORT的浓度往往呈上升趋势[4]，一方面可以帮助机体缓冲和适应应激刺激，但另一方面也是导致机体发生应激疾病的重要因素。本实验结果表明，慢性应激后，大鼠血清中CORT水平显著增高，但在3周时出现恢复，与对照组水平无显著差异。上述结果提示，慢性应激可以显著影响机体的内分泌系统，长时间高水平激素的作用可能与应激诱导的学习记忆损伤密切相关;3周时CORT水平的短时间下降可能与机体对应激刺激的适应性有关，而随着应激时间的延长，机体则可能不再继续适应而造成损伤。

海马、前额皮质是与大脑学习记忆功能密切相关的脑区[5，6]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信号分子在上述脑区表达丰富，并对神经细胞信号转导起着重要的介导作用，从而调控大脑功能。其中研究最多的是ERK1/2(分别为p44和p42 MAPK)，其主要功能与细胞的增殖与分化相关。在中枢神经系统中，ERK是记忆形成的相关分子，海马ERK1/2的磷酸化对于学习记忆过程是必不可少的[7]，使用 ERK通路阻断剂PD98059能够抑制海马长时程增强(long-term potentiation，LTP)的诱导[8]。我们在实验中发现，慢性复合应激可以引起大鼠大脑海马、前额皮质P-ERK水平的下降，3周时P-ERK水平有所回升，可能与机体的适应有关，但4周时上述脑区P-ERK的水平再次下降。上述结果表明，慢性复合性应激对大脑海马、前额皮质ERK信号分子磷酸化的作用主要是下调，而在3周时的短暂回升可能是由于机体对应激刺激的适应性变化引起的，而当应激刺激持续作用，机体不能继续适应时，P-ERK水平再次下降。Meller等[9]发现慢性应激可以引起大鼠大脑ERK1/2磷酸化水平的降低，这与我们的实验结果基本一致，但该实验并未检测慢性应激影响MAPKs信号分子表达活化的时间效应。在本实验中，应激后大鼠ERK1/2磷酸化水平具有与学习记忆能力相似的变化趋势，提示慢性复合应激可能通过降低海马、前额皮质ERK1/2的磷酸化水平而介导了大鼠学习记忆能力的损害。

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