乙肝病毒X蛋白对凋亡蛋白PDCD5表达的影响及意义

郭锋伟， 赵志辉， 杨盛力， 袁祖成， 薛 磊

乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)是一种多功能蛋白，其与肝炎及肝癌的发生发展关系密切。HBx同细胞凋亡的关系很复杂，有些研究者认为HBx可抑制肝细胞凋亡［1-2］，促进肝细胞增生;而其他研究者得出的结论是HBx可促进肝细胞凋亡［3-4］。同时，HBx和肝癌多药耐药关系密切，其可通过激活NF-κB信号通路上调P-gp的表达［5］。PDCD5是由北京大学人类疾病基因研究中心克隆成功的新的凋亡相关蛋白，国际人类基因命名委员会将其命名为程序化细胞死亡因子5(programmed cell death 5，PDCD5)［6］，是一种重要的凋亡正调节因子，研究表明其在肝癌中低表达可能与肝癌的发生发展有关，并可能是导致肝癌多药耐药的原因之一［7］。HBx和PDCD5都和肝癌发生及凋亡关系密切，两者之间的关系目前国内外尚未见报到，为此我们进行了以下研究。

1 资料和方法

1.1 资料和试剂 鼠抗人HBx单克隆抗体购于CHEMICON公司;鼠抗人PDCD5单克隆抗体(浓度为0.5 g/L)由北京大学人类疾病基因中心陈英玉教授惠赠;脂质体转染剂 lipofectamine 2000，G418为美国Invitrogen公司产品;DMEM、胎牛血清购于美国Hyclone公司;PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;正常人肝细胞L02购自中国典型物种保藏中心，pcDNA3.1-HBx为本实验室保存。

1.2 稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白的L02细胞系的建立与鉴定 将L02细胞接种于24孔板中，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中生长至60%～80%后融合。按照试剂说明书将pcDNA3.1-HBx和pcDNA3.1质粒用脂质体转染L02细胞，转染24 h后，将细胞消化，分布在24孔板中，用含500 mg/L G418的培养液筛选20 d，得到单克隆细胞，再改用含250 mg/L G418的培养液维持至传代，备份。得到的细胞系命名为L02/HBx细胞系和L02/pcDNA3.1细胞系。通过RT-PCR和Western Blot进行鉴定，HBx引物序列:上游为 5'-TCCTTTGTTTACGTCCCGTC-3'，下 游 为 5'-TGCCTACAGCCTCCTAATAC-3'。内参照β-actin引物序列:上游为5'-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3'，下 游 为 5'-ATGTCACGCACGATTTCC-3'。鼠抗人HBx单克隆抗体稀释度 1∶500，二抗稀释度 1∶4 000，化学发光法(ECL)显色。

1.3 Real-time PCR 技术检测 L02/pcDNA3.1 和L02/HBx细胞中PDCD5 mRNA的表达 收获培养液中的L02/pcDNA3.1细胞L02/HBx细胞，提取细胞总RNA，检测RNA的浓度和纯度，取相同量的mRNA逆转录为cDNA，每组cDNA均以基因引物加荧光染料复合物sybrGreen Mix(2×)进行定量PCR反应，每个反应做3个复孔。经预实验，将逆转录的cDNA稀释5倍为模板。PDCD5引物序列:上游为5'-ACCCAAGTTCTGGATCAGTCG-3'，下 游 为 5'-AGTTGTCCATATCTTGCCATCTG-3'。内参照β-actin引物序列:上游为5'-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3'，下游为 5'-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3'。总反应体系共 25 μL:sybrGreen Mix 12.5 μL，cDNA 模板2 μL，10 μM 上游引物和 10 μM 下游引物各 1 μL，ddH2O 8.5 μL。反应条件:95℃变性 2 min，40 次循环内95℃变性15 s，60℃退火 15 s，72℃延伸 45 s，72℃再延伸10 min，重复3次。

1.4 蛋白质印迹法(Western Blot)检测L02/pcDNA 3.1和L02/HBx细胞中PDCD5蛋白的表达 收获培养液中的2种细胞，用三去污裂解法提取细胞总蛋白，所得总蛋白经15%聚丙烯酰胺凝胶电泳转移至硝酸纤维素膜上，PDCD5一抗稀释度1∶500，二抗稀释度1∶3 000，化学发光法(ECL)显色，计算机扫描蛋白质条带并作灰度分析。以β-actin作内参照，PDCD5/β-actin(灰度值的比值)代表 PDCD5蛋白相对表达水平，每个样本重复3次。

1.5 统计学处理 应用SPSS 11.0统计分析软件进行数据分析，计量资料采用t检验或方差分析，计数资料采用 χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乙型肝炎病毒X蛋白的L02细胞系的建立通过PCR和Western Blot可以检测到L02/HBx中有HBx mRNA(图1)和蛋白(图2)的表达，对照组细胞中未见表达。

图1 HBx mRNA转染图M:markers(最亮的条带为400 bp);A:对照细胞;B:转染细胞

图2 Western blot检测对照细胞和L02/HBx细胞中HBx蛋白的表达1:L02/pcDNA3.1细胞;2:L02/HBx细胞

2.2 Real-time PCR 技术检测 L02/pcDNA3.1 和L02/HBx细胞中PDCD5 mRNA的表达情况 Realtime PCR结果显示，转染HBx基因后，L02/HBx细胞中PDCD5 mRNA表达水平明显增加，与 L02/pcDNA3.1细胞相比，为其 1.95 ±0.13 倍(n=3)，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图3。

图3 Real-time PCR检测L02/pcDNA3.1和L02/HBx细胞中PDCD5 mRNA的表达

2.3 蛋白印迹法检测L02/pcDNA3.1和L02/HBx细胞中PDCD5蛋白的表达 Western blot结果显示，转染HBx基因后，L02/HBx细胞中PDCD5蛋白表达水平明显降低，与L02/pcDNA3.1细胞相比，为其1.84±0.25倍(n=3)，差异有统计学意义(P ＜0.05)，见图4。

图4 Western blot检测L02/pcDNA3.1细胞和L02/HBx细胞中PDCD5蛋白的表达1:L02/pcDNA3.1 细胞;2:L02/HBx细胞

3 讨论

乙肝病毒X蛋白通过直接作用和信号通路2种途径，广泛激活病毒与细胞的启动子，参与多种基因的调控，与肝癌的发生、发展、侵袭转移、化疗耐药关系密切。而HBx同肝细胞凋亡的关系极为复杂，部分研究显示HBx抑制肝细胞凋亡，促进肝细胞增生，部分研究结果显示HBx促进肝细胞凋亡。推测不同的结果可能与HBV感染的不同阶段以及HBx自身表达量有关，也可能是不同实验所用的刺激因子和细胞类型不同等因素所致，亦或HBx本身对凋亡具有双重调节作用。

TFAR19(TF-1 cell apoptosis-related gene 19)是北京大学人类疾病基因研究中心马大龙教授从人白血病细胞株TF-1细胞中克隆得到的新凋亡相关基因，国际人类基因命名委员会建议命名为PDCD5(programmed cell death 5)，是我国拥有自主知识产权的新功能基因［8］。研究发现PDCD5能促进肿瘤细胞的凋亡和抑制细胞生长，在细胞凋亡的早期高表达并能快速核转位，早于细胞膜磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)的外翻和细胞核内DNA片段化，与凋亡早期核染色质结构的功能紊乱密切相关［8］。腺病毒介导的PDCD5基因转染促进了依托泊苷诱导的K562细胞凋亡［9］，PDCD5单克隆抗体导入HeLa细胞，可以抑制由足叶乙苷诱导的细胞凋亡［10］，这些都说明PDCD5在细胞凋亡的过程中发挥着重要作用。

本研究显示在L02细胞中转染HBx基因后PDCD5表达上调，一定程度上促进了细胞的凋亡，但不能就此推导出HBx促进肝细胞凋亡，因为我们前期的另一项研究表明(也在该细胞系中进行)HBx也可以上调凋亡抑制蛋白Livin的表达［11］。由此可见HBx同凋亡的关系是非常复杂的，可能具有双重调节作用，而细胞凋亡是多个基因相互作用的最终结果。

［1］Zhang JL，Zhao WG，Wu KL，et al.Human hepatitis B virus X protein promotes cell proliferation and inhibits cell apoptosis through interacting with a serine protease Hepsin［J］.Arch Virol，2005，150(4):721-741.

［2］Li D，Chen X，Zhang W.The inhibition of apoptosis of hepatoma cells induced by HBx is mediated by up-regulation of survivin expression［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2003，23(4):383-386.

［3］Cheng P，Li Y，Yang L，et al.Hepatitis B virus X protein(HBx)induces G2/M arrest and apoptosis through sustained activation of cyclin B1-CDK1 kinase［J］.Oncol Rep，2009，22(5):1101-1107.

［4］Kim HJ，Kim SY，Kim J，et al.Hepatitis B virus X protein induces apoptosis by enhancing translocation of Bax to mitochondria［J］.IUBMB Life，2008，60(7):473-480.

［5］杨盛力，陈孝平，张万广，等.乙肝病毒X蛋白通过激活核因子-κB信号通路上调MDR1的表达［J］.中华实验外科杂志，2008，25(12):1603-1605.

［6］马大龙.新细胞因子及细胞凋亡基因的发现与功能研究［J］.北京大学学报(医学版)，2002，34(5):488-492.

［7］杨盛力，陈孝平，张万广，等.PDCD5在肝癌组织中的表达及其临床意义［J］.中国普通外科杂志，2008，17(7):721-724.

［8］Chen Y，Sun R，Han W，et al.Nuclear translocation of PDCD5(TFAR19):an early signal for apoptosis?［J］.FEBS Lett，2001，509(2):191-196.

［9］阮国瑞，陈珊珊，常艳，等.腺病毒介导PDCD5基因转移促进依托泊甙诱导的K562细胞凋亡［J］.中国实验血液学杂志，2007，15(5):936-940.

［10］Rui M，Chen Y，Zhang Y，et al.Transfer of anti-TFAR19 monoclonal antibody into HeLa cells by in situ electroporation can inhibit the apoptosis［J］.Life Sci，2002，71(15):1771-1778.

［11］杨盛力，陈孝平，张万广，等.肝癌组织中Livin基因表达及与乙型肝炎病毒X蛋白的关系研究［J］.中华普通外科杂志，2008，23(12):921-923.