健脾益气方含药血清对人胃癌细胞株MKN-28凋亡的影响

邢晓静 ，谷小虎，赵 岩，椰慧楠，郑洪新

(1辽宁省肿瘤医院，沈阳110042;2辽宁中医药大学)

中医理论认为，健脾益气为胃癌的基本治则［1］。2010年6～12月，我们采用血清药理学方法，观察健脾益气方含药血清对人胃癌细胞株MKN-28凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 人胃癌细胞株MKN-28(购自上海细胞库)。高糖DMEM培养基(Thermo Fisher公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，Hoechst染色试剂盒、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物公司)，MTT(Sigma公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 MKN-28培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下的培养箱中培养，细胞贴壁生长。每2～3 d传代1次，选用对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 健脾益气方含药血清制备 用水煎法提取健脾益气方药物成分(参照张奋:硕士学论文2008，化痰散结中药甲肿消对甲状腺细胞凋亡影响的实验研究中的方法)，过滤、浓缩、得生药浸膏剂。取空腹(禁食12 h)的雄性Wistar大鼠16只，随机分为两组:中药组10只，按成人(65 kg体质量)药物剂量的10倍量灌胃，2 ml/次、2次/d、连续7 d;无药组6只，生理盐水灌胃，2 ml/次、2次/d、连续7 d。两组无在末次灌胃1 h后，股动脉采血，放置2 h促凝，1 500 r/min离心10 min，收集上清(分别为含药和无药血清)，过滤，－80℃冷冻保存备用。

1.2.3 细胞分组及细胞增殖抑制率测算 取MKN-28(5 000/孔)，分别加入2.5%、5.0%、7.5%、10.0%含药血清培养(含药组)，添加胎牛血清使培养体系总血清比例为10%;以加入无药血清的细胞为对照(对照组)，所加大鼠血清浓度梯度与含药组等同;以加入正常培养基培养的细胞为空白组，分别在培养24、48、72 h时，采用MTT法检测波长为490 nm处的OD值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=(空白组OD值－实验组OD值)/空白组OD值×100%。含药组、对照组均为实验组。

1.2.4 细胞形态观察 将MKN-28接种于含盖玻片细胞培养板中，分别加入 5.0%、7.5%、10.0% 的含药血清，48 h后行Hoechst33258染色，共聚焦显微镜下观察各组细胞形态、荧光强度、细胞核形态。对照组同理。

1.2.5 细胞周期测定 取MKN-28 1×105个接种至细胞培养瓶中，分别加入 5.0%、7.5%、10.0% 的含药血清，48 h后，采用流式细胞术测定细胞周期。对照组同理。

1.3 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件，抑制率及细胞周期比较采用t检验，相关性分析采用一元回归分析法。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度含药血清对MKN-28增殖抑制率的比较 见表1。含药组MKN-28增殖抑制率与作用时间(R2分别为 0.912、0.897、0.995)和血清浓度梯度(R2分别为 0.996、0.973、0.972、0.978)呈正相关(P 均 ＜0.05)。

表1 加入不同浓度血清培养24、48、72 h时两组MKN-28增殖抑制率比较(%，±s)

表1 加入不同浓度血清培养24、48、72 h时两组MKN-28增殖抑制率比较(%，±s)

注:与对照组相同时点、血清浓度比较，*P＜0.05，△P＜0.01;与同组相同时点、高一血清浓度比较，#P＜0.05，▲P＜0.01;与同组相同浓度、前一时点比较，●P ＜0.05，□P ＜0.01

组别 MKN-28增殖抑制率24 h 48 h 72 h对照组2.5% 0.00 ±5.18 3.87 ±7.10 15.77 ±4.65 5.0% 0.83 ±3.79 3.85 ±9.40 20.84 ±1.62 7.5% 3.31 ±2.96 7.55 ±9.00 19.44 ±6.51 10.0% 8.73 ±9.56 12.89 ±6.43 25.03 ±4.49含药组2.5% 3.12 ±2.99 14.73 ±8.29●□ 28.99 ±3.42△▲□5.0% 3.69 ±4.42# 17.67 ±4.87*#●□ 42.98 ±3.45△▲□7.5% 15.25 ±3.69△ 29.52 ±3.47△▲●□ 55.59 ±2.70△▲□10.0% 24.09 ±7.95▲ 50.37 ±4.10△▲●□ 65.84 ±3.46△▲□

2.2 细胞形态学观察 含药组细胞染色呈强蓝色荧光，经5%含药血清处理后，细胞核出现浓缩现象，表现为着色较深;经7.5%含药血清处理后，细胞核浓缩加剧，呈现致密浓染;10.0%含药血清处理后，细胞核呈碎块状致密浓染。对照组细胞染色呈微弱荧光，细胞核完整。

2.3 细胞周期检测 含药组四倍体期细胞所占比例下降。详见表2。

表2 加入不同浓度血清培养48 h两组MKN-28细胞周期比较(±s)

表2 加入不同浓度血清培养48 h两组MKN-28细胞周期比较(±s)

注:与对照组相同血清浓度比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与同组高一血清浓度比较，#P＜0.05

组别 二倍体期(%) 四倍体期(%)对照组5.0% 61.71 ±2.91 38.29 ±2.91 7.5% 61.71 ±1.70 38.29 ±1.70 10.0% 64.06 ±1.63 35.94 ±1.63含药组5.0% 65.02 ±1.20*# 34.98 ±1.20*#7.5% 68.34 ±1.15＊＊ 31.66 ±1.15＊＊10.0% 69.87 ±1.99＊＊ 30.13 ±1.99＊＊

3 讨论

胃癌发病原因尚不清楚，多数病例确诊时已属中晚期，疗效欠佳［2］。研究证实，某些中药有效成分如大蒜素、苦参碱、白藜芦醇等对胃癌细胞具有增殖抑制作用，并可诱导胃癌细胞发生凋亡［3］。

健脾益气方由茯苓、木香、蜈蚣、陈皮、当归等组成。已有研究证实，茯苓对提高肿瘤患者的T淋巴细胞活性，特别是CD4+/CD8+具有较明显的效果［4］;木香中的木香倍半萜则对人肺癌细胞株A549、胃癌细胞株SGC-7901和白血病细胞株K562、HL-60等有增殖抑制作用［5］;蜈蚣中含有类组胺物质，对胃癌细胞、肝癌细胞具有抑制作用［6］。本研究采用血清药理学方法观察健脾益气方含药血清对胃癌细胞的作用，可避免中药粗提物直接加入反应体系中，提高实验结果的可信度。

本研究结果显示，健脾益气方含药血清对MKN-28存在增殖抑制作用，且与含药血清浓度和作用时间呈梯度依赖性。经含药血清处理后，MKN-28出现细胞核浓缩现象，呈致密浓染;四倍体期细胞所占比例下降，且高浓度含药血清比低浓度含药血清的细胞凋亡诱导效应明显增强，说明健脾益气方含药血清具有诱导MKN-28细胞凋亡的作用。

［1］王玉，章永红.胃癌的中医研究进展［J］.长春中医药大学学报，2009，25(5):791-792.

［2］张玉超，申虎，雷海龙，等.胃癌治疗的研究进展［J］.中外医疗，2010，29(14):191-192.

［3］王艳艳，王威，李红岩.中药有效成分抗胃癌作用研究进展［J］.中国药房，2007，18(30):2383-2385.

［4］许小娟.参苓白术散治疗消化系统恶性肿瘤术后胃肠功能紊乱58例［J］.吉林中医药，2006，26(1):21.

［5］王潞，赵烽，何恩其，等.18种木香倍半萜对6种人源肿瘤细胞增殖的影响［J］.天然产物研究与开发，2008，20(5):808-812.

［6］曲爱兵，赵维城，梁良，等.蜈蚣组织提取物抗肿瘤活性的初步研究［J］.实用肿瘤学杂志，2003，17(1):29-30.