白藜三醇对兔心肌梗死后血管新生的诱导作用＊

马洁，周召锋，徐晤，张超群，张卓琦，王志荣

心肌梗死是当今社会威胁人类健康，致死致残的主要原因，其传统治疗方法如溶栓、血管成形术、外科搭桥术都有相应的局限性［1］。慢性冠状动脉闭塞已经展示了对侧支动脉发展的诱导，其重建使得主要血流通过微血管或血管再生流向濒死心肌。近十几年来研究发现白藜三醇具有抗炎、抗氧化及明确的心血管系统的保护作用，包括缩小梗死面积［2］。白藜三醇是一种黄体酮类多酚单体化合物，它能否促进血管生成尚不清楚。本研究拟建立兔心肌梗死模型，观察白藜三醇慢性给药对心肌梗死后血管新生、冠状动脉侧支循环形成、梗死面积的影响，并进一步探讨其作用及机制。

1 材料与方法

实验动物:我们于2010-03至2010-08选择新西兰大耳白兔(雌雄不拘)32只，体重(2500±50)g，由徐州医学院动物中心提供。试剂:白藜三醇(湖南洪江华光生物有限责任公司)，胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和细胞表面的唾液粘蛋白(CD34)一抗(北京博奥森生物技术有限公司)，血管内皮生长因子-A(VEGF-A)一抗(美国，millipore公司)，反转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(美国，promega公司)，免疫组化染色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

实验分组及动物模型的建立:32只新西兰白兔随机分为假手术组、手术对照组、白藜三醇组、消心痛组，每组8只。假手术组中左冠状动脉前降支(LAD)仅穿线不结扎，其余三组兔于左心房下缘1～2cm处结扎左前降支建立急性心肌梗死模型，术后青霉素钠80万单位肌注3天。

术后药物干预及取材:假手术组及手术对照组予7%酒精3ml，白藜三醇组予白藜三醇3mg/kg(溶于7%酒精3ml)，消心痛组予消心痛2.4mg/kg(溶于7%酒精3ml)，均灌胃，1次/天。2周后，取存活兔心脏，石蜡包埋、切片;留取梗死边缘区组织－80℃保存。

指标检测:4组白兔均经以下5种指标检测，①苏木精—伊红染色法(HE染色)及马松三色染色法(Masson染色)检测梗死区、非梗死区心肌病理变化:应用image pro plus 6.0图像分析软件，参照 Litwin等［3］的方法计算心肌梗死面积。②梗死边缘区微血管密度的检测:梗死周边2mm界定为梗死边缘区［2］。免疫组化法检测梗死边缘区CD34抗原，采用文献中所述方法［4］，以 CD34标记计数微血管密度(MVD)。③免疫组化化学染色定量分析各组梗死边缘区微血管密度及IGF-1、bFGF的表达:将IGF-1及bFGF染色后的切片，应用显微镜在相同光源强度下，于400×视野每张切片随机选取梗死边缘区5个视野的图像，待资料汇总后，通过image pro plus图像分析软件检测其平均光密度值(optical density，OD)。④western-blot测定各组梗死边缘区心肌IGF-1、b FGF、VEGF-A的蛋白表达:以每个样品的总蛋白为100 μg上样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至硝酸纤维素膜上，一抗(IGF-11∶100，b-FGF 1 ∶50，VEGF-A 1 ∶1000)封闭 4℃过夜，二抗(1∶100)37℃孵育1 h，红外荧光显色。ImageJ图像分析仪进行半定量分析。⑤RT-PCR测定各组梗死边缘区VEGF-A的mRNA的表达:以GeneBank中目的基因序列为模板设计引物，序列如下:VEGF-A上游引物5’GGG CTC ATG GAC GGG TGA GG3’，下游引物5’TCA CCG CCT CGG CTT GTC AC3’;β-actin 上游引物5’CTA CGA GGG CTA CGC GCT GC3’，下游引物5’CGA GAG AGG GTG TCC CGC CA3’(引物由上海Invitrogen生物公司合成)。RT反应条件:室温10 min，45℃ 50 min，94℃ 5 min，0℃ 10 min;PCR 反应条件:94℃ 5 min 预变性;94℃ 1 min，57℃ 1 min，68℃1 min共40个循环;终末延伸68℃ 7 min。取RT-PCR反应产物4 μl于1.5%琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像扫描及分析系统，测定目的基因与内参基因的积分吸光度比值。

统计学处理:计量数据采用均数±标准差表示，SPSS13.0统计软件进行统计学处理。分别行方差齐性检验、单因素方差分析(ANOVA)。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

一般情况:27只动物存活至治疗结束，总存活率为84.4%(27/32)。

手术对照组，白藜三醇组，消心痛组HE染色及Masson染色:HE染色可见未梗死部位的心肌细胞排列整齐紧密，肌纤维走向明晰，细胞分界清楚，胞核椭圆形位于中央，胞质呈嗜酸性均匀染色，而梗死区室壁变薄，外膜至内膜间心肌纤维数量减少，肉芽组织、纤维组织和脂肪组织增生明显，各种细胞排列紊乱，少量散在的心肌细胞。Masson染色梗死部位纤维结缔组织呈蓝色，正常心肌纤维呈紫红色或深红色。

心肌梗死面积及梗死边缘区微血管密度测算:依据HE、Masson染色结果，手术对照组、白藜三醇组及消心痛组梗死边缘区微血管密度较假手术组明显增加(P＜0.05)，白藜三醇组及消心痛组较手术对照组明显增加(P＜0.05)，差异均有统计学意义;白藜三醇组与消心痛组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。白藜三醇组及消心痛组心肌梗死面积明显低于手术对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，而白藜三醇组与消心痛组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。(表1)

表1 各组心肌梗死面积及梗死边缘区微血管密度比较()

表1 各组心肌梗死面积及梗死边缘区微血管密度比较()

注:与假手术组比较*P＜0.05;与手术对照组比较△P＜0.05

组别 例数 心肌梗死面积(%)梗死边缘区微血管密度(个)假手术组8.31±2.51手术对照组 6 33.81±3.76 13.32±2.75*白藜三醇组 7 22.82±4.10△ 25.15±3.74＊△消心痛组 7 23.08±3.69△ 24.54±2.577 0＊△

VEGF-A、IGF-1及bFGF表达情况:白藜三醇组、消心痛组较假手术组、手术对照组能明显增加VEGFA(蛋白及mRNA 表达)、IGF-1(OD，蛋白表达)、bFGF(OD，蛋白表达)的表达(P＜0.05)，差异均有统计学意义;手术对照组较假手术组VEGF-A(蛋白及mRNA表达)、IGF-1(OD，蛋白表达)表达增加(P ＜0.05)，差异均有统计学意义，但bFGF表达两组之间差异无统计学意义(P＞0.05);消心痛组IGF-1(OD，蛋白表达)的表达水平较白藜三醇组明显降低(P＜0.05)，差异有统计学意义，VEGF-A、bFGF两组之间差异无统计学意义(P＞0.05)(western-blot与RT-PCR所测VEGF-A结果相一致;western-blot与免疫组化化学染色法所测IGF-1、bFGF 结果相一致)。(图 1，图 2，表2)

图1 各组心肌IGF-1、bFGF蛋白表达 IGF-1:胰岛素样生长因子-1 bFGF:碱性成纤维细胞生长因子 β-actin:β-肌动蛋白。1:假手术组(7例)2:手术对照组(6例)3:白藜三醇组(7例)4:消心痛组(7例)

图2 各组VEGF-A的mRNA及蛋白表达图2A为mRNA表达图2B为蛋白表达。VEGF-A:血管内皮生长因子-A β-actin:β-肌动蛋白 mRNA:信使核糖核酸 DNA marker:脱氧核糖核酸分子标记。除手术对照组样本数为6例，其余均为7例

表2 各组梗死边缘区胰岛素样生长因子-1、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子-A的表达量比较()

表2 各组梗死边缘区胰岛素样生长因子-1、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子-A的表达量比较()

注:与假手术组比较*P＜0.05;与手术对照组比较△P＜0.05;与白藜三醇组比较▲P＜0.05。IGF-1:胰岛素样生长因子-1 bFGF:碱性成纤维细胞生长因子 VEGF-A:血管内皮生长因子-A OD:光密度值

假手术组(n=7) 手术对照组(n=6) 白藜三醇组(n=7) 消心痛组(n=7)IGF-1(OD) 0.0029±0.0030 0.0199±0.0088* 0.1506±0.0557＊△ 0.0829±0.0243＊△▲IGF-1(蛋白表达) 0.1171±0.0916 0.3701±0.0778* 1.2062±0.2495＊△ 0.6671±0.0716＊△▲bFGF(OD) 0.0082±0.0089 0.0367±0.0464 0.0928±0.0341＊△ 0.0934±0.0459＊△bFGF(蛋白表达) 0.2884±0.0748 0.4160±0.1481 0.8663±0.1562＊△ 0.8961±0.1075＊△VEGF-A(蛋白表达) 0.6508±0.0762 0.9225±0.0642* 1.2314±0.0556＊△ 1.2259±0.0752＊△VEGF-A(mRNA表达) 0.5491±0.0171 0.7452±0.0361* 1.0169±0.0604＊△ 0.8898±0.0419＊△

3 讨论

临床研究证明，靠机体启动再生新的血管以适应缺血变化的过程非常缓慢，因此，在血管成形术、外科搭桥术不能奏效的时候，人为地增加心肌局部生长因子的浓度，对缓解以致解除心肌缺血有潜在的可行性。有人在大鼠的心肌及后肢肌缺血等模型中，应用生长因子进行实验性治疗，结果表明，缺血的骨骼肌可建立大量的侧支循环;在心肌中，微血管密度增加，引起冠状动脉血流量的增加，梗死面积的显著缩小及心功能的明显改善。心肌梗死后冠状动脉原有侧支开放的程度有限，不足以代偿机体的需要，而血管新生促侧支循环形成则有重要意义。良好的侧支循环在减少心肌缺血和梗死的范围、保护存活心肌、抑制心肌细胞凋亡、改善心肌重构和心功能有着积极的作用。我们的前期工作发现，消心痛和白藜三醇均可以开通急性心肌梗死的侧支循环。

消心痛作为硝酸酯类药物是外源性一氧化氮供体，其作为临床上对冠心病患者传统药物的应用，能明显改善患者心肌缺血的症状。既往有许多研究表明，新生血管的形成与一氧化氮合酶—一氧化氮系统的关系密切。有研究表明eNOS转基因治疗可减少大鼠心肌梗死的面积，其机制可能与激活TGF-β/Samd2信号通路、增加血管生成有关［5］。我们的研究发现，兔急性心肌梗死后，消心痛喂养两周可明显减少心肌梗死面积，增加心肌缺血区微血管的密度，其机制可能涉及消心痛体内转化为一氧化氮，促进多种生长因子的直接或间接表达增加。

范虞琪［6］报道了白藜三醇对动脉粥样硬化的预防作用及直接扩张血管作用。Kaga等［2］研究发现白藜三醇在体外试验中可促进人冠状动脉内皮细胞形成管腔形态，在活体试验中给予白藜三醇预处理可减少大鼠心肌梗死面积。有个别报道证实白藜三醇在心肌缺血再灌注方面保护心脏［7］。诸多研究证实，白藜三醇是一个有希望抵抗冠心病，多方面保护心脏的物质。本文首先建立兔心肌梗死模型，然后予包括白藜三醇等不同的药物干预，两周后证实心肌梗死后应用白藜三醇可以减少心肌梗死面积，增加微血管密度，诱导心肌梗死后IGF-1、bFGF、VEGF-A的表达，且与手术对照组相比，差异具有统计学意义。其中，IGF-1差异最为显著，较消心痛组明显增加，差异具有统计学意义，说明其机制可能与硝酸脂类促血管生成作用有所不同。近年来对IGF-1的研究提示，IGF-1对内皮功能的改善可以通过与内皮存在高亲和力位点并与之相互作用产生一氧化氮［8］并通过抗细胞凋亡和抗炎作用来抵抗内皮功能障碍。通过介导血管舒张［9］来调整血管紧张度和动脉血压，同时保存冠状动脉血流储备［10］。在内皮细胞和血管平滑肌细胞上，IGF-1可以通过酪氨酸激酶膜受体与胰岛素受体1和2的结合并相互作用增加一氧化氮合酶的活性［11］，并持续、缓慢释放一氧化氮，增加血管舒张。有实验证实IGF-1能提高缺血的预处理，并通过其抗细胞凋亡和钾离子通道的开放来减少缺血损伤［12］;IGF-1在小鼠身上的超表达能保护心肌梗死后的心肌细胞，减少心肌细胞的死亡，并减弱心室壁的压力，减缓心室的扩张及肥大，并能抵抗非梗塞冠状动脉的收缩对心脏造成的损害［13］。因此，结合本实验结果，白藜三醇诱导血管发生与多种血管生长因子表达增多相关，有利于侧支循环的进一步形成，其对心血管系统的保护作用主要与介导IGF-1的高表达相关。

［1］韩雅玲.重视冠状动脉搭桥术后桥血管病变的介入治疗.中国循环杂志，2005，5(20):321-322.

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［6］范虞琪.白藜芦醇对动脉粥样硬化的预防作用.上海交通大学学报，2007，4:465-467.

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