亚麻脱胶菌HW201的培养条件优化

2011-05-23曹亚彬奚新伟吴皓琼郭立姝牛彦波

中国麻业科学 2011年1期

曹亚彬，奚新伟，吴皓琼，郭立姝，牛彦波，殷博

（黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨 150010）

自上世纪50年代，我国的科技工作者就开展了加菌温水沤麻方面的研究与应用工作，随后进行的工作对技术进行了补充和创新，高性能的菌株不断涌现，应用效果不断提高。现有的研究报道中，使用的菌株集中在芽孢杆菌属，分别使用了厌氧芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、费氏芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等。在使用效果上达到了缩短沤麻周期、提高出麻率、改善纤维质量及减少污水排放等目的。加菌温水沤麻技术能够解决亚麻原料企业生产中的实际问题，但菌剂的高成本也是限制该项技术应用的因素之一。在本文中，以降低生产成本为目的，研究了适合工业化生产的培养基配方组成和培养条件。

1 材料与方法

1.1 试验材料：本单位分离保藏的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HW201，化学试剂为分析纯，玉米面、豆粕粉市场采购，生产试验用磷酸氢二钾、碳酸钙为市场采购的工业产品。

1.2 测定方法：菌体计数采用平板计数法[1]；使用数显型酸度计PHS-3C直接测定培养液的pH；采用DNS比色法测定总糖[2]。

1.3 芽孢率测定方法：待测样品1.0mL，加入到9mL的90℃以上水中，迅速混匀后加入到沸水浴中处理10min，取出迅速冷却到室温。以此为基础样本进行平板培养计数，统计代表样品中芽孢数量。以未经热处理的原始样品为对照测定菌体总数，两者的百分比为芽孢率。

1.4 杂菌率测定方法：在平板培养基上生长的非目的菌落，视为杂菌，杂菌占菌落总数的百分比即为杂菌率。

1.5 培养基优选试验[3]：依据34正交表中的要求配制培养基，培养基100mL装入250mL三角瓶中，1.0kgf/cm2压力下灭菌。接种枯草芽孢杆菌HW201菌悬液1.0mL，摇床120r/min、32℃下培养48hr。试验数据利用Latin统计学软件进行处理。

1.6 生产试验：在黑龙江省生物技术工程中心的2m3和5m3的发酵设备中进行。以玉米面1.5%，豆粕粉1.5%，磷酸氢二钾0.4%，碳酸钙0.4%和适量的消泡剂组成生产用培养基，培养条件为温度32±1℃、通风量 1：0.8、时间 60hr。

1.7 固体菌剂制备：以液体方式生产的菌液，以2.5：1的固液比，用80目稻壳粉吸附，60℃低温烘干24hr后备用。

2 结果与讨论

2.1 培养基组成优选

2.2 培养条件

表1 正交表的试验设计（水：100mL）Table 1 The orthogonal experimental design（water：1000mL）

表中试验结果为三次测定结果的平均值；培养条件：31±1℃，250mL三角瓶装量100mL，摇床转速120r/min，48hr。

以正交试验得到的最佳培养基进行培养条件试验，具体的培养条件根据试验要求进行调整，试验的结果列于图2。试验结果表明，枯草芽孢杆菌HW201的最佳培养温度36℃，在30～38℃之间生长良好，在26℃时也有一定的生长能力；枯草芽孢杆菌HW201适宜在中性（pH6.5～7.5）条件下生长，超出此范围生长受到明显影响，相比较而言，碱性条件的影响较弱。对摇床转速的试验结果表明，随转速的提高，菌体浓度呈上升趋势，说明增加通气提高培养基中氧含量有利于菌体的生长，总体上分析，转速对菌体生长的影响小于温度和pH。培养过程中菌体数量、pH、总糖的变化列于图3中，在培养过程中，随菌体数量的生长，总糖不断下降，在48hr后两者达到稳定，菌体数量达到1014个/mL以上。培养液颜色在36hr～48hr内开始出现变化，逐渐由黄、青、青灰、灰褐至黑褐色。由于培养基中使用碳酸钙作为pH缓冲剂，培养过程中pH比较平稳，保证了菌体在适宜的pH下快速生长。

图1 单因子直观分析Figure 1 The visual analysis ofsingle factor

图2 枯草芽孢杆菌HW201的培养条件Figure 2 The culture condition ofBacillus subtilis HW201

图3 枯草芽孢杆菌HW201培养过程中成分变化Figure 3 The changes ofcomponents in the trainingprocess for Bacillus subtilis HW201

2.3 生产试验结果

以玉米面1.5%，豆粕粉1.5%，磷酸氢二钾0.4%，碳酸钙0.4%和适量的消泡剂组成生产用培养基，控制培养条件为温度32±1℃、通风量1：0.8，分别在2m3和5m3的发酵罐中进行生产试验（表2）。菌体生长在24hr后进入旺盛生长期，培养进行到48hr时进入稳定生长期，菌体浓度分别达到1.1×1014cfu/mL和2.3×1014cfu/mL，芽孢率分别为12.4%和10.1%；在60hr培养结束，芽孢率分别达到22.3%和21.5%，菌体的浓度分别达到2.4×1014cfu/mL与4.8×1014cfu/mL。在产品分装后的液体贮存过程中，菌体浓度在15d内迅速下降，由2.4×1014cfu/mL下降到7.6×1011cfu/mL，芽孢率迅速上升，由22.3%上升到64.6%，也开始出现轻微的污染，杂菌率为1.37%。此后菌液保存到30d时，菌体浓度、芽孢率变化不大，杂菌率显著上升达到7.33%。发酵罐生产出的菌液以2.5：1的固液比，用80目稻壳粉吸附，60℃低温烘干24hr后，水分降低到4.3%。以此作为固体菌剂进行贮存试验，初始固体菌剂的菌体数量达到8.4×1013cfu/g，芽孢率达到86.4%；在贮存过程中，菌体数量呈下降趋势，芽孢率呈上升趋势，但幅度不大；在试验的过程中无杂菌污染发生。两种菌剂相比，固体菌剂有明显的优势，有利于菌体的贮存和使用。

表2 枯草芽孢杆菌HW201生产试验培养结果Table 2 The culture result ofproduction test for Bacillus subtilis HW201

表3 枯草芽孢杆菌HW201菌剂贮存试验Table 3 The preservation test for the agent ofBacillus subtilis HW201

3 讨论

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是比较常见的微生物菌群，在工农业生产中有较多应用，对该属微生物的研究很深入。本文研究的用于沤麻的枯草芽孢杆菌，在培养方式上与其他的芽孢杆菌基本一致，无特殊的营养要求，可以用常规的发酵技术和低成本的培养基对其进行大规模的培养。在贮存过程中，液体中菌体出现大量的死亡，数量急剧下降，其原因是⑴密闭包装造成的厌氧环境，不适合这种芽孢杆菌的生长，出现生理性死亡；⑵在液体条件下有利于各种自溶酶发挥作用，不利于菌体的休眠，加速了菌体的死亡速度。而固体菌剂中的菌体处于休眠状态，有利于产品保存，对整体技术的推广使用有重要作用。

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