99TCM-BNAO-乙二醇独甲醚的合成及其生物分布

黄华璠,周 浩,黄士堂,褚泰伟

(北京大学化学与分子工程学院放射化学与辐射化学重点学科实验室北京分子科学国家实验室,北京 100871)

99Tcm-BnAO作为一种非硝基咪唑类乏氧显像剂,在临床上具有乏氧显像的应用价值[1-4]。然而体外细胞实验发现,99Tcm-BnAO的乏氧与正常细胞放射性摄取比偏低[5],动物体内实验结果显示,肿瘤与血的放射性摄取比也较低,达不到显像的要求[6]。

本工作拟在配体BnAO的侧链上进行乙二醇独甲醚的修饰,以期提高BnAO脂溶性,从而达到提高99Tcm-BnAO类显像剂在肿瘤内的摄取率,缩短显像时间的目的。

1 实验材料

1.1 主要仪器与装置

自动γ计数器:美国Parckard公司;99Mo-99Tcm发生器:原子高科股份有限公司;APEX IV傅里叶变换高分辨质谱:美国Bruker公司;DY-W1型电泳仪:北京试验设备厂;核磁共振仪:400 MHz,美国Bruker公司。

1.2 主要材料与试剂

实验所用试剂均为分析纯;99Tcm-BnAO药盒:北京欣科思达医药科技有限公司;聚酰胺薄层板:浙江台州市路桥四青生化材料厂。

1.3 动物模型

雄性昆明小鼠:一级,体重20～25 g,由中科院动物所实验动物室提供;S180细胞株:北京大学生命科学学院提供。在小鼠左腋下移植S180肉瘤,10 d后,肿瘤直径约1.5 cm时进行动物实验。

2 实验方法

2.1 BnAO-乙二醇独甲醚的合成

BnAO及BnAO-乙二醇独甲醚化学结构示于图1,BnAO-乙二醇独甲醚的合成路线示于图 2 。[7-8]

图1 BnAO及BnAO-乙二醇独甲醚的结构

于150 mL乙醚中加入9.97 g 3-甲基-2-烯-1-丁醇,冷却至-5℃。逐滴加入15 mL PBr3并保持温度在0℃以下,电磁搅拌45 min。逐滴缓慢加入100 mL NaCl溶液淬灭反应。分离出有机相,用Na2 SO4干燥,于常温下减压旋蒸,得到产物 1-溴-3-甲基-2-丁烯约 4.5 g,产率约80%。

图2 BnAO-乙二醇独甲醚的合成路线

2.4 mL乙二醇独甲醚溶于 10 mL无水THF,逐份加入共 0.6 g NaH,于室温搅拌15 min。再加入0.8 mL产物 1-溴-3-甲基-2-丁烯,室温搅拌1 h。减压蒸馏,残留物溶于二氯甲烷。过滤溶液,用10 mL稀盐水洗涤。分离出有机相,用MgSO4干燥,减压蒸馏。残留物用柱色谱纯化,展开剂为V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=10∶1,得到产物1-(2-甲氧基乙氧基)-3-甲基-2-丁烯约0.5 g。产率约40%。

1 g 1-(2-甲氧基乙氧基)-3-甲基-2-丁烯和1.2 mL亚硝酸异戊酯用干冰丙酮浴冷却至-30℃,剧烈搅拌均匀。在 1 h内逐滴加入1 mL冷却的1 mol/L HCl,再搅拌 2 h。整个过程中保持温度＜-20℃。在低温下真空抽滤反应物,沉淀用10 mL冷乙醚洗涤,得到产物3-氯-1-(2-甲氧基乙氧基)-3-甲基-2-亚硝基丁烷约0.35 g,产率约25%。

于1.0 mL乙腈中加入0.3 mL二异丙基乙基胺,再加入200 mg 3-氯-1-(2-甲氧基乙氧基)-3-甲基-2-亚硝基丁烷以及40 mg 1,4-丁二胺。于室温反应17 h。过滤反应物,用5 mL去离子水洗涤沉淀,用乙腈重结晶,得到最终产物BnAO-乙二醇独甲醚约86 mg,产率约40%。

2.2 99Tcm-BnAO及99 Tcm-BnAO-乙二醇独甲醚的制备

99Tcm-BnAO-乙二醇独甲醚的制备:用0.1 mol/L碳酸氢钠溶液作为缓冲溶液,加入50μg BnAO-乙二醇独甲醚、25μg酒石酸钠、1μg SnCl2、0.1 mL99TcmO4-,于 75 ℃下反应10 min。薄层色谱法(TLC)检测标记率,聚酰胺薄层为载体,生理盐水为展开剂,上行展开。

实验中的99Tcm-BnAO采用药盒标记,标记率约为95%。将标记产物于室温下放置不同时间后,测定放化纯度,考察标记物的体外稳定性。

2.3 电泳实验

称取 0.68 g KH2PO4和 7.16 g Na2HPO4·12H2O溶于 500 mL去离子水中配制0.05 mol/L p H 7的电解液,倒入电解装置。将99Tcm-BnAO及99Tcm-BnAO-乙二醇独甲醚分别点样于纸条中心,将纸条置于电解装置上,用电解液润湿,通200 V 恒压电解30 min。取出纸条,迅速用电吹风吹干,测量标记物的分布。

2.4 脂水分配系数

在离心管中加入1 mL正辛醇、1 mL生理盐水和10μL标记产物,于涡旋混合器上剧烈震荡3 min,使其充分混匀,然后离心5 min。各取10μL上层正辛醇和下层生理盐水测定计数。平行3次实验。

2.5 生物分布

分别随机选取5只荷S180瘤小鼠,经尾静脉注射0.1 mL(1 MBq)99Tcm-BnAO及99Tcm-BnAO-乙二醇独甲醚标记液 (放化纯度大于90%),分别于注射后 0.5、1、2、4 、8 h 眼眶取血,断颈处死,取出感兴趣区的组织和器官,用水冲洗,拭干后称重,计算每克组织器官中的放射性摄取率(%ID/g)。

3 结果与讨论

3.1 结构表征

结构鉴定:核磁共振1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ10.74(s,2H,C=N-OH),4.23(s,4H,NCH2),3.52(m,4H,NCH2OCH2),3.44(m,4H,CH 2OCH 3),3.24(s,6H,CH 2OCH 3),2.22(m,4H,-NHCH 2—),1.86(m,2H,-NHCH 2—),1.30(m,4H,-NHCH 2CH 2—),1.16(s,12H,C(CH 3)2)。高分辨质谱(ESI)C20H43N4O6[M+H]+:m/z理论值为435.317 71,m/z测量值为435.316 73。上述结果表明所合成的产物为目标产物。

3.2 标记率及体外稳定性

通过对标记体系中p H、SnCl2用量、反应温度、中间络合剂等条件进行优化后,所得99Tcm-BnAO-乙二醇独甲醚标记率大于90%。体系中各组分的Rf:99TcmO2·x H2O胶体,99TcmO4-及99Tcm与酒石酸钠形成的配合物为0～0.3,99Tcm-BnAO-乙二醇独甲醚为0.7～1.0。

标记物于室温下放置6 h后,放化纯度仍大于90%。可见标记产物体外稳定性良好。通过脂水分配系数实验测得99Tcm-BnAO-乙二醇独甲醚的分配系数为0.187±0.009,99Tcm-BnAO为0.165±0.012,通过修饰后标记物的脂溶性有所提高。

3.3 电泳实验

99Tcm-BnAO和99Tcm-BnAO-乙二醇独甲醚电泳实验结果示于图3和图4。图3和图4显示,两个标记物的放射性主要集中在原点,向阳极或阴极迁移非常小。此结果表明,99Tcm-BnAO和99Tcm-BnAO-乙二醇独甲醚为电中性,有利于进行乏氧显像。

3.4 荷S180瘤小鼠体内生物分布

图3 99 Tcm-BnAO电泳分布图

99Tcm-BnAO及99Tcm-BnAO-乙二醇独甲醚在荷S180肉瘤小鼠体内的生物分布分别列于表1和表2。对比表2和表1可知,经过乙二醇独甲醚修饰后,标记物水溶性仍很大,在注射30 min后这两个标记物血液清除都很快。心、肺、胃和肌肉在开始有少量摄取,但很快清除。脑中则几乎无摄取。随着时间延长,99Tcm-BnAO及99Tcm-BnAO-乙二醇独甲醚在肿瘤组织的相对摄取量逐渐增加。99Tcm-BnAO-乙二醇独甲醚的肿瘤与血、肿瘤与肌肉放射性摄取比(T/NT)较99Tcm-BnAO有所降低。

图4 99 Tcm-BnAO-乙二醇独甲醚电泳分布图

表1 99 Tcm-BnAO在荷S180瘤小鼠体内的放射性摄取率(,n=5)

表1 99 Tcm-BnAO在荷S180瘤小鼠体内的放射性摄取率(,n=5)

器官 不同时间的放射性摄取率/(%ID·g-1)0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h血液 1.69±0.32 0.79±0.47 0.55±0.19 0.35±0.17 0.47±0.14心1.54±0.17 0.69±0.23 0.49±0.13 0.34±0.06 0.26±0.02肺2.36±0.11 1.39±0.39 1.21±0.25 0.96±0.19 0.78±0.12肝 10.70±1.01 8.21±1.49 8.02±1.69 7.50±1.34 4.66±0.39脾2.58±0.46 1.63±0.52 1.50±0.25 1.37±0.28 0.93±0.11胃2.18±0.39 1.40±0.49 0.96±0.28 0.91±0.35 0.55±0.04肾4.06±0.68 2.07±0.62 1.83±0.59 1.15±0.18 0.80±0.17肌肉 1.22±0.24 0.49±0.19 0.24±0.06 0.20±0.03 0.14±0.02骨头 1.04±0.42 0.51±0.18 0.40±0.10 0.30±0.05 0.25±0.06脑0.31±0.03 0.23±0.07 0.15±0.03 0.11±0.02 0.09±0.00肿瘤 1.60±0.35 1.18±0.33 1.03±0.12 0.77±0.27 0.61±0.13小肠 3.66±0.92 4.92±2.18 3.26±1.22 1.69±0.22 0.67±0.04

表2 99 Tcm-BnAO在荷S180瘤小鼠体内的放射性摄取比,n=5)

表2 99 Tcm-BnAO在荷S180瘤小鼠体内的放射性摄取比,n=5)

器官T/NT 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h肿瘤与血液 0.94±0.14 1.67±0.44 2.05±0.66 2.40±1.04 1.35±0.24肿瘤与肌肉 1.36±0.47 2.54±0.53 4.44±1.04 3.94±1.25 4.44±0.92

表3 99 Tcm-BnAO-乙二醇独甲醚在荷S180瘤小鼠体内放射性摄取率,n=5)

表3 99 Tcm-BnAO-乙二醇独甲醚在荷S180瘤小鼠体内放射性摄取率,n=5)

器官不同时间的放射性摄取率/(%ID·g-1)0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h血液 1.19±0.21 1.12±0.63 0.58±0.11 0.40±0.09 0.23±0.15心0.78±0.02 0.77±0.39 0.35±0.01 0.28±0.02 0.24±0.04肺1.03±0.06 0.97±0.46 0.56±0.06 0.47±0.03 0.40±0.09肝5.13±1.50 5.10±2.50 2.93±0.60 2.61±0.66 1.93±1.01脾0.96±0.06 0.81±0.38 0.55±0.08 0.40±0.04 0.31±0.07胃1.69±0.28 1.53±0.91 1.74±0.79 1.37±0.37 1.04±0.16肾2.61±0.30 2.17±1.04 1.21±0.14 0.99±0.07 0.88±0.25肌肉 0.71±0.09 0.55±0.29 0.24±0.12 0.15±0.01 0.14±0.02骨头 0.67±0.06 0.58±0.21 0.39±0.09 0.35±0.05 0.28±0.04脑0.11±0.01 0.10±0.03 0.07±0.00 0.05±0.00 0.05±0.01肿瘤 1.03±0.06 0.85±0.37 0.60±0.07 0.41±0.19 0.44±0.04小肠 4.84±0.89 2.48±1.10 1.78±1.03 1.03±0.27 0.66±0.29

表4 99 Tcm-BnAO-乙二醇独甲醚在荷S180瘤小鼠体内的放射性摄取比(,n=5)

表4 99 Tcm-BnAO-乙二醇独甲醚在荷S180瘤小鼠体内的放射性摄取比(,n=5)

器官T/NT 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h肿瘤与血液 0.90±0.23 0.80±0.13 1.06±0.28 1.05±0.51 1.27±0.12肿瘤与肌肉 1.47±0.21 1.65±0.40 2.76±0.76 2.71±1.16 3.21±0.24

4 结 论

99Tcm-BnAO作为乏氧显像剂在临床上具有一定的肿瘤乏氧诊断的应用价值,但是仍存在一些不足。本工作在配体BnAO的侧链上进行乙二醇独甲醚的修饰,希望适当改变脂溶性,但是通过生物分布实验发现实际效果并不明显。因此,要改善99Tcm-BnAO类乏氧显像剂的性能,还需要大量的研究。

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