D-核糖产生菌抗噬菌体菌株的选育

任蓓蕾 史小莉 闫世梁 崔凤霞

（郑州拓洋实业有限公司技术中心，河南 郑州 450066）

D-核糖（D-Ribose，D-R）是一种具有重要生理意义的五碳糖，广泛应用于食品及医药工业，是目前合成维生素B2的重要原料，也可用于合成抗病毒、抗肿瘤的药物[1]。它的生产方法主要有三种，一是抽提法，二是化学合成法，三是生物发酵法。前两种因其产率低、成本高、环境污染大等诸多问题，在规模化生产中基本上被淘汰，而生物发酵法是葡萄糖利用微生物发酵生产，因其成本低、易于大规模生产、环境污染较小等优点[2],已得到国内外D-核糖生产厂家的普遍采用。D-核糖发酵是磷酸戊糖途径(I-IMP)的非氧化支路缺失，使微生物改变酶系，积累阻断反应的前体来进行代谢控制发酵的[3]，但D-核糖产生菌--枯草芽孢杆菌转酮醇酶变异株常常会受到噬菌体的污染而使生产受到影响，抗噬菌体菌株的选育是发酵工业噬菌体防治的重要方法之一。国外已将菌株的抗噬菌体特性作为评价或筛选发酵剂优良菌株的重要标准[4]。为此，我们从D-核糖的异常发酵液中分离纯化了噬菌体并开展了抗噬菌体菌株的选育工作，本文报道了此项研究结果。

1 材料和方法

1.1 材料。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）转酮醇酶（Transketolase）变异株 XB02，本公司自备。

噬菌体P001，本公司异常发酵液中分离纯化而得。

1.2 培养基

1.2.1 肉汤培养基

牛肉膏0.5%、蛋白胨1.0%、可溶性淀粉2.0%、NaC1 0.5%、酵母膏0.1%，pH值7.0-7.2，加入琼脂2.0%则为固体培养基。该培养基用于细菌和噬菌体的保藏、扩增及活化等。

1.2.2 噬菌体培养基

上层培养基配比：淀粉1%，精解蛋白胨0.2%，NaC1 0.1%，NaNO30.1%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，FeSO4·7H2O 0.001%，琼脂 1%，pH 7.8-8.0；

下层培养基配比：牛肉膏0.3%，蛋白胨1.0%，NaC1 0.5%，琼脂2.0%，pH 7.4-7.5。

1.2.3 种子培养基

葡萄糖2.0%、酵母膏0.35%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%，pH7.0-7.2。

1.2.4 发酵培养基

葡萄糖20%、玉米浆3%、(NH4)2SO40.6%、CaCO3 3.6%、MnSO4·4H2O 0.005%。pH 7.0-7.2。

1.3 培养方法

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敏感菌株、抗性菌株及噬菌体在肉汤培养基或双层琼脂培养基上的培养温度为35±0.5℃，培养时间为24h。噬菌体原液的制备、摇瓶种子培养及发酵均在旋转式摇床上进行，培养温度为 35±0.5℃，转速 220rpm，培养周期分别为24、20和72h。

50L发酵罐的培养条件：温度为35±0.5℃，罐压为 0.1Mpa，搅拌转速为 400rpm，通气量为 1：0.5v/v/m。

1.4 噬菌体的分离纯化、原液制备及效价测定

取D-核糖异常发酵液4000r/min离心20min。上清液经微孔滤膜过滤除菌得到含有噬菌体的样液，然后在双层琼脂平板上进行噬菌体的分离。噬菌体的分离、纯化及原液制备参照文献[5，6]。噬菌体效价测定采用双层平板法[7]。

1.5 抗噬菌体菌株的选育方法

1.5.1 抗噬菌体菌株的筛选

抗噬菌体菌株的选育方法采用紫外线诱变法。从活化好的敏感菌斜面中刮出菌苔，制成单细胞悬浮液。在直径6cm的培养皿中加入3mL单细胞悬浮液，放人暗箱并用电磁搅拌器进行搅拌，在l5w紫外灯下距离（20cm 、25cm）照射(15、20、25s)(紫外灯先预热 20min，使其波长稳定)。黑暗中静置30min后，取菌悬液1mL接入种子培养基中，同时加入噬菌体液1mL(108pfu/m1)，摇床振荡培养24h后取培养液进行适当稀释，将其涂布于肉汤培养基平板上培养，挑取单菌落用划线点滴法[8]测定其对噬菌体的抗性，同时对其进行镜检，挑选出既具有抗性又与出发菌株相似的菌株。将这些菌株分别接入种子培养基中，同时加入噬菌体混合培养。比较上述菌株在摇瓶发酵中的产D-核糖能力，最后选出既有稳定抗性又高产的菌株作为目的菌株。

1.5.2 抗性菌株遗传稳定性试验

将选育获得的抗性菌株分别含噬菌体的液体种子培养基、发酵培养基进行连续传代。每次传代后用双层琼脂法、35±0.5℃培养48h做抗性检查。在低倍镜下观察是否出现噬菌斑。

1.6 测定方法

D-核糖含量的检测采用苔黑酚法[9]。菌体生长量(OD值)的测定：用蒸馏水稀释发酵液10倍，以蒸馏水作空白，用721分光光度计测定发酵液在590nm处的光密度。

2 结果与讨论

2.1 噬菌体的分离纯化和浓缩

经多次分离、纯化，从D-核糖的异常发酵液中获得了一种噬菌体，将其命名为P001，它在双层琼脂平板上可产生一种形态基本一致的噬菌斑。P001的噬菌体为透明的边缘清晰的圆形噬菌斑，直径约2.4mm左右。将纯化后的噬菌体加入已接菌的种子培养基中进行增殖培养，可以得到效价达1000pfu/mL以上的噬菌体原液。

2.2 抗噬菌体菌株的选育

以枯草芽孢杆菌转酮醇酶变异株XB02为出发菌株，经紫外线诱变法诱变，得出最佳诱变工作参数为：采用15W紫外灯 (预热20min)下，距离25cm照射25S。获得了16株对噬菌体P001具有抗性的变异菌株，挑选出生长正常产D-核糖能力、生长状况与出发菌株相近的菌株5株。经多次复筛获得了2株抗噬菌体的D-核糖高产菌株Kp03、Kp14。菌株Kp03、Kp14在噬菌体存在的条件下产D-核糖水平达到了对照敏感株的正常产D-核糖水平（如表1）。

2.3 菌株Kp03、Kp14抗噬菌体能力的检测

将菌株Kp03、Kp14及敏感株XB02分别接入混有0.2 mL噬菌体原液（效价1000pfu/mL）的种子液中进行摇瓶发酵培养。在整个培养过程中，敏感菌株XB02的生长受到明显抑制，并产生大量的噬菌体，培养液中噬菌体的浓度最高可达1005pfu/mL以上。而抗株Kp03、Kp14表现正常，对试验浓度下的噬菌体P001具有明显的抗性。

2.4 抗噬菌体菌株的遗传稳定性

在噬菌体P001存在的条件下。对抗株Kp03、Kp14进行摇瓶种子培养和发酵试验，考察了多次传代后抗株的种液OD值及发酵产D-核糖能力；结果表明抗株Kp03在种子培养及发酵中出现异常现象，遗传稳定性差。而抗株Kp14在种子培养及发酵过程中均未出现抗性改变的现象，具有较好的遗传稳定性，镜检也未发现异常情况。

2.5 抗噬菌体菌株的发酵性能测定

按敏感菌株XB02的发酵条件，在生产环境中噬菌体大量存在的情况下，在50 L的发酵罐上对抗株Kp14进行了连续5批次的发酵试验(表2)。结果表明，在发酵过程中，抗株Kp14与敏感株XB02的正常发酵大致相同，未出现受噬菌体污染的迹象。从产D-核糖能力上看，抗株Kp14这5批次的平均发酵转化率达到了50.61%，平均D-核糖产量达91.48 g/L，平均发酵周期52 h，与未受噬菌体污染的敏感株XB02基本相当。

结论

本文对D-核糖产生菌--枯草芽孢杆菌转酮醇酶变异株XB02抗噬菌体菌株的选育进行了研究，通过紫外诱变得到了遗传特性稳定、发酵性能与出发菌株相似的抗株Kp14。但要把该抗株放心地用于工业生产，还要对它的最适发酵培养基、发酵的工艺条件等进行进一步的研究。

[1]邱蔚然,高淑红.发酵法生产 D-核糖[J].工业微生物，2003，30(1)：58-64.

[2]Sasajima K，Yoneda M.Carbohydrate metabolism-mutants of a Bacillus species part II.D -ribose accumulation by pentose phosphate pathway mutants[J].Agr Biol Chem，1971，35(4)：509-517.

[3]王树庆，张咏梅，张克旭.D-核糖高产菌株的选育[J].工业微生物，2OO2，32(2)～22-25.

[4]吕加平,于景华,骆承庠.乳酸菌发酵剂优良菌种的选育 [J]中国乳品工业 ，2002，30(5)：49-53.

[5]余茂劾,司挥东.噬菌体实验技术[M].北京：科学出版社.1991.

[6]LU Z，BREIDT F J，FLEM IN G H P，et a1.Isolation and Characterization of a Lactobacillus Plantarum Bacteriophage,L-1，from a Cucumber Fermentation [J].IntemationalJournal ofFood Microbiology，2003(84)：225-235.

[7]范秀容,沈 萍.微生物学实验[M].北京：高等教育出版社.1988：l02.

[8]余茂效，那淑敏，董扣洪，等.抗噬菌体产a-淀粉酶菌株的选育 [J].微生物学报，1986，26(3)：232.237.

[9]彭其安，张西峰，吴思方，等.同源重组法构建枯草芽孢杆菌转酮酶缺失突变菌株 [J].生物技术，2006，16(6)：23-16.