细菌内毒素法检查银杏叶提取物注射液的热原

刘 肃

(广州市药品检验所,广东 广州 510610)

银杏叶提取物注射液(商品名:金纳多)属心脑血管扩张药,每支含有银杏叶提取物17.5mg,其中银杏黄酮甙4.2μ g。银杏总黄酮具有扩张冠脉血管、脑血管,改善脑缺血产生的症状和记忆功能,对治疗冠心病、脑动脉硬化、老年性痴呆等病有一定的疗效。

金纳多的检验标准规定了热原检查项目,未收录细菌内毒素检查项目。细菌内毒素检查具有灵敏度高、检测范围相对较窄(革兰氏阴性菌代谢产物)而热原检查检测范围广(所有致热原物质)、灵敏度低等特点。我们在对金纳多的热原检测基础上做干扰试验,并与家兔法进行了比较,以寻找一种简易可行、准确可靠的检测方法。

1 仪器与试药

TW12六孔恒温水浴(Julabo公司);MSI旋涡混合器(广州IKA公司)。

细菌内毒素工作标准品(规格:每支120EU,批号:150601-200699)购自中国药品生物制品检定所;细菌内毒素检查用水(BET水 ,规格:每支 50mL,批号:1007161)及鲎试剂(TAL)A(规格:每支 0.1mL,批号:1005071,灵敏度:0.25 EU◦mL-1)购自湛江安度斯生物有限公司;TAL B(厦门市鲎试剂实验厂有限公司,规格:每支0.1mL,批号:100101,灵敏度:0.25 EU◦mL-1);金纳多,台湾济生化学制药厂股份有限公司,批号:EB156,EB108,EB095。

2 方法与结果

2.1 细菌内毒素限值(L)的确定

本品热原检查剂量M=1mL◦kg-1,人用每公斤体重每小时可接受的内毒素剂量K=5EU◦kg-1,按公式L=K/M=5EU◦mL-1,即为金纳多的内毒素检查限度。

2.2 鲎试剂灵敏度复核试验

按照2010年版《中国药典》(二部)附录细菌内毒素检查法规定,进行鲎试剂的标示灵敏度(λ)复核。结果见表1。

表1 鲎试剂灵敏度复核试验结果

由表1可见,两批鲎试剂经用细菌内毒素工作标准品检查,λ c均在0.5λ～2.0λ之间,结果均符合规定。

2.3 干扰预试验

目前用于药品检验的市售鲎试剂灵敏度(λ)一般在0.25 EU◦mL-1～0.03 EU◦mL-1之间,故金纳多进行细菌内毒素检测时,最大稀释倍数MVD=CL/λ,分别为 20倍、40倍、80倍、160倍(L=5 EU◦mL-1)。取3批金纳多,用BET水将供试品稀释20倍、40倍、80倍、160倍共4个浓度梯度的溶液,将此系列浓度溶液标记为供试品管(NPC系列)。用上述稀释液作为溶剂,溶解并稀释细菌内毒素工作标准品,制得每个稀释度中细菌内毒素含量均为2λ(0.5 EU◦mL-1和0.25 EU◦mL-1)的金纳多溶液,标记此系列溶液为供试品阳性对照管(PPC系列)。取灵敏度为0.25 EU◦mL-1的两个不同厂家的鲎试剂进行试验,每一稀释度做2管,同时按常规分别设细菌内毒素阳性对照(PC)和检查用水阴性对照(NC)各2管,结果见表2。

表2 供试品干扰预试验结果

从表2结果可见,所用的3批金纳多稀释20倍或更大倍数时,对两个厂家的鲎试剂反应无增强或抑制的干扰作用。

2.4 正式干扰试验

用两个厂家的鲎试剂(灵敏度为0.25EU◦mL-1),按中国药典2010年版二部附录的细菌内毒素检查法进行试验,测定用BET水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值(Es)和用供试品稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值(Et)。取3批金纳多,分别用BET水稀释20倍,用BET水和供试品稀释液分别将细菌内毒素工作标准品稀释成 2λ、1λ、0.5λ、0.25λ浓度,每一稀释浓度重复4管,同时用上述供试品稀释液和BET水各做2管阴性对照管,按公式计算BET水和供试品稀释液反应终点浓度的几何平均值(Es和Et),Es=lg-1(∑Xs/4),Et=lg-1(∑Xt/4),结果见表3。

表3 供试品(稀释20倍)干扰试验结果

从表3结果可见,2λ、1λ管均为阳性,0.5λ、0.25λ管均为阴性,对于λ=0.25EU◦mL-1的2组鲎试剂的Es为0.25 EU◦mL-1,3批金纳多测得的Et和Es的比值均在0.5～2.0之间,说明金纳多在稀释20倍或更大倍数时对两个不同厂家的鲎试剂反应无干扰作用,符合中国药典2010年二部对细菌内毒素检查有效性的规定,因此可以确定金纳多的最大无干扰浓度为稀释20倍。

2.5 样品细菌内毒素检查

取3批金纳多,分别根据“2.4”项下方法制成供试品稀释液,使用λ=0.25EU◦mL-1的两个厂家的鲎试剂进行细菌内毒素检查,按中国药典2010年版二部细菌内毒素检查法检查,结果见表4。

表4 样品细菌内毒素检查结果

从表4结果可见,阴性对照管(NC)均为阴性,供试品阳性对照管(PPC)和阳性对照管(PC)均为阳性,实验有效;供试品管(NPC)均为阴性,表明样品中未检出细菌内毒素,3批金纳多的细菌内毒素检查均符合规定。

3 讨论

细菌内毒素检查法因其具有灵敏度高、快速、准确、简便的特点和优点,目前已被各国药典所采纳,作为替代热原检查法的一种检测方法用于控制药品的质量。不同厂家的鲎试剂由于生产工艺、质量参数等方面有一定差异,其抗干扰能力存在差异。因此,本实验采用两个不同厂家不同灵敏度的鲎试剂对3个批号的样品进行试验。从正式干扰试验结果可见,样品稀释20倍时,Es/Et均在 0.5～2.0范围之内,可认为金纳多在该浓度下不干扰细菌内毒素检查。用两个厂家鲎试剂与3批样品进行细菌内毒素检查,样品中细菌内毒素限量均在 5EU◦mL-1限值以下,符合规定,这与热原检查的结果也是一致的。因此,银杏叶提取物注射液采用限值5EU◦mL-1进行细菌内毒素检查法代替热原检查法是可行的。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].二部.北京:中国医药科技出版社,2010:附录99.