谷胱甘肽合成酶基因St GCS-GS的表达提高大肠杆菌对重金属的抗性

李平平，柳生奎，邱志奇，安志刚*

(1.东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心，哈尔滨150040;2.广州中山大学生命科学学院，广州510275)

重金属是一类主要的环境污染物，对生物的生存构成严重威胁。有些重金属如 Co，Cu，Fe，Mn，Ni，Zn是生物体所必需的微量元素，通过形成稳定的复合物在生化反应中起着重要的作用。如催化代谢反应，调节细胞的渗透压，稳定蛋白质和细胞壁结构［1-3］。生物体所需这些重金属含量是极低的。而其他非必需重金属如Ag，Al，Cd，Au，Pb和Hg则没有任何生理生化作用，非必需重金属元素和过量的必需重金属元素对生物都是有害的。重金属对生物体的毒害作用主要有三种:软性金属，如Cd，Hg，Ag能够与巯基发生化学作用［4］，使得活性位点含有巯基的酶失去活性，或者与细胞内重要的微量元素相互作用，抑制其生理功能［3］。有氧化还原活性的重金属，如Cu，Fe，Mn直接参与氧化反应。其他重金属，如 Ni，Co，Zn能够通过呼吸作用、光合作用氧化传递链的解耦联，或降低谷胱甘肽 (GSH)含量间接造成氧化逆境，导致细胞内活性氧自由基积累。

真核生物体内存在一些蛋白或多肽类，如金属硫蛋白 (MTs)、谷胱甘肽 (GSH)和植物络合素(phytochelatins，PCs)等所具有的-SH具有与金属离子结合形成硫肽复合物的功能，这些复合物通过一些转运蛋白的作用能够运输到胞外，或者将其储存在液泡等细胞器内，降低重金属的毒性。金属硫蛋白主要参与铜离子平衡，而植物络合素(PCs)和谷胱甘肽 (GSH)则主要对Cd离子的有效解毒起主要作用。

谷胱甘肽 (GSH)是由谷氨酸和半胱氨酸、甘氨酸三个氨基酸组成的三肽，广泛存在于生物体内，主要由谷氨酰半胱氨酸合成酶 (γ-GCS)和谷胱甘肽合成酶 (GS)催化的两个连续反应合成，其中γ-GCS受产物GSH的反馈抑制。编码γ-GCS和GS的基因gshA及gshB已被测序并克隆出来，早期研究表明γ-GCS催化活性受GSH的反馈抑制［5］。GSH有多种生物功能，与其分子结构有着密切关系。分子结构中的活性巯基重要的生化作用，使其能络合金属离子，降低重金属对细胞的毒害。且其作为一种抗氧化剂，能够清除重金属毒性产生的活性氧自由基。所以，提高GSH的含量可能提高生物体对重金属的耐性。采用转基因技术在植物、微生物体内过量表达大肠杆菌γ-GCS或GS，可以将GSH含量提高2～6倍［6］。在印度芥菜中分别过量表达了γ-GCS、GS这两种酶，均增加了植物对Cd的耐性和积累［7-8］。但在拟南芥中过量表达γ-GCS却未增加Cd的耐性［9］。在烟草中过量表达大肠杆菌的γ-GCS反而引发了严重的氧化胁迫［10］。这种表型可以通过转入GS部分恢复过来。在以后的研究中发现，适当的平衡γ-GCS和GS这两种酶的活性、并且定位在相同的部位 (细胞质或质体)是提高GSH含量的关键［6］。

在植物、微生物体内表达革兰氏阳性菌无乳链球菌的谷胱甘肽合成酶基因StGCS-GS可以解决这一问题。该功能基因是编码具有γ-GCS和GS两种活性的双功能融合蛋白γ-GCS-GS，且γ-GCS的催化活性对GSH的反馈抑制不敏感。Bjorn等研究也表明GSH对S.agalactiae的γ-GCS-GS的的γ-GCS催化活性影响较小，且在应用试验的条件下，S.agalactiae的细胞中确实积累了大量的GSH(304 ± 11nmol/mg protein)［11］。Verena 等在烟草中表达这种酶，叶片中积累了大量的GSH，是野生型的20～30倍，且未对植株生长产生有害影响，并表现出对Cd较强的耐性［6］。目前未见在原核生物中过量表达该酶的报道。

本文将无乳链球菌的同属菌嗜热链球菌 (S.thermophilus)的功能基因StGCS-GS转入大肠杆菌，得到了转化菌株，并对其在重金属Cd、Ni、Cu胁迫条件下的生长情况进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒和菌株

所用大肠杆菌 (Eshenchia coli)菌株为Rosetta-gamiTM(含有质粒pETG-10A+GCSGS)。起始质粒为pETG-10A，质粒图如图1所示。采用Gateway技术将StGCS-GS基因克隆到原核表达载体pETG-10A上 (与中山大学合作)。

1.1.2 试剂

生物素标记的羊抗兔Ig G抗体 (与中山大学合作开发)。

图1 质粒图Fig.1 Plasmid map

1.2 方法

1.2.1 His-GCS-GS融合蛋白的表达与纯化

取含有质粒pETG-10A+GCS-GS的大肠杆菌过夜培养物各2 ml，加入到含有50 μg/ml Amp的LB培养基中进行培养，并在37℃的温度下振荡培养，待菌液浓度为OD600=0.5时，加入0.1 mM IPTG，进行诱导培养。收集菌液。6 000 g/4℃/10 min离心，弃上清，沉淀至于冰上。加入5ml冰冷的裂解缓冲液 (50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，10mM imidazole，PH 8.0)，悬浮细胞沉淀;再向悬浮液中加入含1 ml 10 g/L溶菌酶、6 μl 1M PMSF，冰浴30 min，进行细胞裂解;13 000 g/30 min/4℃ 离心，将上清液转移到新的离心管中。与此同时加入1 ml Ni-agarose于蛋白纯化柱中，静止30min。然后加蛋白液于柱中，进行目的蛋白的纯化;待总蛋白溶液被充分吸附后，用5倍体积的漂洗缓冲液 (50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，20mM imidazole，PH 8.0)漂洗杂蛋白;清洗完毕后，加入300 μl洗脱缓冲液 (50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，250mM imidazole，PH 8.0)，静止30min，收集洗脱液，重复3次。取15 μl样品进行SDS-PAGE电泳检测，用考马斯亮蓝进行胶染色;纯化后的目的蛋白置PB(pH 7.0)缓冲液中，过夜透析。取适量进行SDS-PAGE电泳，并进一步Western blot检测。

1.2.2 Western blot

SDS-PAGE结束后，取出胶，置转移缓冲液(20 ml Tris-base，11.26 g甘氨酸，200 ml甲醇，dH2O容至1L)浸泡20min。将表达产物电转移到硝酸纤维膜上，加入新鲜配制的封闭液 (含5%的脱脂奶粉的的TBS)4℃封闭过夜。弃去封闭液，加入一抗 (1:5000)室温振荡孵育1h。将结合了一抗的硝酸纤维膜置于洗膜缓冲液 (加200μl Tween 20于200mldH2O中)中洗3次，每次10min。用生物素标记的羊抗兔Ig G为二抗 (1;2000)室温振荡孵育1h。洗去二抗，用100ml检测平衡液 (100mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH 9.5)平衡，1～5min。NBT/BCIP室温避光显色至出现理想条带，照相。

1.2.3 转基因大肠杆菌在重金属胁迫条件下的生长状态的比较

将含有pETG-10A+GCS-GS和野生型的大肠杆菌 (Rosetta-gamiTM)单克隆接种于2mlLB液体培养基中37℃/200rpm振荡培养过夜。取5ul菌液加入200mlLB中扩大培养10h。测定OD600，计算使50ml菌液浓度OD值达到0.5所需菌液的量，3000rpm/10min集菌，将收集的菌体加入50ml对照培养基以及分别含有0.5mM CdCl2、0.75mM CdCl2、1mM CdCl2、1Mm NiSO4、2mM NiSO4、3mM NiSO4、0.5 mM、1.5 mM、3 mM 和 5mM CuCl2的LB培养基中，37℃/200rpm振荡培养。每2h测一次OD600值，共测定20h，并用Excel表格对数据进行统计分析。

图2 纯化融合蛋白His-GCS-GS在浓度10%上的聚丙烯酰胺凝胶电泳图Fig.2 10%SDS-PAGE of His-GCS-GS proteins isolated by affinity chromatography from culture supernatant

2 结果与分析

2.1 His-GCS-GS融合蛋白的纯化与鉴定

表达产物经亲和层析和透析脱盐后，取适量进行SDS-PAGE并进一步Western Blot鉴定。SDSPAGE结果显示纯化后融合蛋白纯度较高如图2所示，Western blot结果证实成功获得His-GCS-GS融合蛋白如图3所示。

图3 利用抗体对His-GCS-GS融合蛋白进行Western blot分析Fig.3 Western blot analysis of His-GCS-GS fusion protein

2.2 转基因大肠杆菌对重金属Cd、Ni和Cu的耐受性

在正常条件下，Petg10A+GCS-GS转化菌和野生对照菌的生长势几乎没有差别，如图4(a)所示。在加入不同的重金属后，两个菌株的生长势出现了差异。在不同浓度的CdCl2胁迫下，转化菌和对照菌的生长都受到抑制，但随着CdCl2浓度的增加，两者的耐受差异逐渐增大，当浓度为1mM时，差异最明显，如图4(b)所示，转化菌的数量几乎是对照菌的2倍。在NiSO4存在条件下，当NiSO4浓度较低时 (1mM)，两者的生长势无明显差别。当NiSO4浓度为2mM时，两者的耐受差异最明显，如图4(c)所示，转化菌的数量约是对照菌的2倍。在CuCl2的浓度分别为0.5 mM、1.5 mM、3 mM和5 mM时，两者的生长势无明显差别。以上结果表明，嗜热菌StGCS-GS基因的表达对大肠杆菌在Cd、Ni胁迫下的生长发挥重要作用。

3 讨论

图4 转StGCS-GS基因的大肠杆菌在重金属胁迫条件下的生长曲线Fig.4 Growth curve of StGCS-GS-expressing E.coli cells to heavy metal stress

Cd、Ni对大肠杆菌的毒害作用主要是使其细胞内产生过多的过氧化物，从而引起氧化胁迫［13］。目前，细菌细胞内主要存在3种重金属抗性机制。一是通过外排机制来限制细胞内的重金属浓度。二是与含有巯基的复合物相结合。三是改变重金属离子的氧化态，降低其毒性［1］。大量文献记载，植物中也同样存在这些重金属耐受机制［13］。GSH作为一种抗氧化剂直接参与逆境胁迫产生的活性氧簇的还原。而且能够络合重金属，在细胞内重金属的解毒起重要作用。大量研究表明，通过在植物中过量表达GSH合成相关的基因，能够提高其对重金属的抗性。除真核生物之外，细菌也依靠细胞内的GSH来抵御重金属毒害。自身不能合成GSH的细菌也会利用胞外的GSH或胞内其他的巯基化合物如谷氨酰半胱氨酸 (γ-EC)来替代GSH［14］。本文向大肠杆菌中转化StGCS-GS基因，得到了与Verena等［6］人相似的研究结果，过量表达嗜热链球菌 (S.thermophilus)的谷胱甘肽双功能合成酶基因提高了大肠杆菌对重金属Cd的抗性。为进一步研究该基因在其他重金属胁迫下的功能，本文又研究了过量表达该基因的大肠杆菌在Ni、Cu胁迫下的耐受性。结果表明，过量表达该基因提高了对Ni的耐受性，对Cu的耐受性却没有提高。推测原因可能是在这种遗传背景下，GSH可能不是抵抗Cu胁迫所必需的。

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