双波长RP-HPLC法测定清开灵胶囊中栀子苷和黄芩苷的含量

师永花

清开灵组方源于中医治疗急性热病传统处方“温病三宝”中的安宫牛黄丸，由胆酸、猪去氧胆酸、黄芩苷、珍珠母、栀子、水牛角、板蓝根、金银花组成，迄今为止已形成系列产品［1］。中药制剂分析中，多使用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)。清开灵胶囊中君药黄芩的黄酮类有效成分为黄芩苷，臣药栀子的环烯醚萜苷类的有效成分为栀子苷。为了更好地控制药品质量，本文采用双波长RP-HPLC法，同时测定该制剂中的栀子苷和黄芩苷含量。

1 仪器与试剂

1.1 实验仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪(真空脱气机，四元泵，自动进样器，二级管阵列检测器)，色谱柱:Hibor C18键合硅胶柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);AS3120型超声波清洗器;Mettler Toledo AB204-S电子分析天平。

1.2 实验试剂 无水甲醇:分析纯、色谱纯，乙腈:色谱纯，水为重蒸馏水;栀子苷对照品:中国药品生物制品检定所，批号:0749-9401供含量测定用;黄芩苷对照品:中国药品生物制品检定所，批号:715-8501，供含量测定用;清开灵胶囊:广州白云山明兴制药有限公司，批号:MM3112、MM3111、MM3113，规格:0.25 g×12粒。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取减压干燥至恒重的黄芩苷对照品1.8 mg、栀子苷对照品1.6 mg，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解后，定容至刻度，即得含黄芩苷、栀子苷分别为0.18 mg/mL、0.16 mg/mL的对照品储备溶液。分别精确量取上述标准品溶液，按体积1∶1混合，即得标准品混合溶液，其中栀子苷:0.08 mg/mL;黄芩苷:0.09 mg/mL。

2.1.2 样品溶液的制备 取样品适量，置研钵中研细，取粉末约0.25 g，精密称定，置25 mL容量瓶中，精确加入无水甲醇定容，超声提取30 min，放冷，擦净容量瓶外表水分，补足减失甲醇重量，摇匀，静置。用被甲醇润洗的注射器吸取适量上清液，再用0.45 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性样品溶液的制备 分别制备不含黄芩、栀子阴性对照样品，并按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。

2.2 色谱条件 色谱柱:Hibor C18键合硅胶柱(4.6 mm ×160 mm，5 μm)。流动相:A 相为0.2%磷酸水溶液，B相为乙腈。梯度洗脱程序:0～10 min时，流动相为B相-A相(12∶88)，流速:0.8 mL/min;10 min之后，流动相为B相-A相(25∶75)，流速:1.0 mL/min。检测波长分别为240 nm(栀子苷)、278 nm(黄芩苷)。柱温:30℃。流动相梯度洗脱配比和流速数据见表1。

2.3 专属性试验 取对照品混合溶液、各阴性样品溶液、样品溶液，在上述色谱条件下分别进样分析。结果表明，在样品溶液色谱图中，有与对照品混合溶液栀子苷、黄芩苷保留时间一致的特征峰，保留时间分别为7.50 min、16.00 min，阴性样品无此特征峰，表明阴性样品对所测组分无干扰。色谱图见图1、图2。

表1 流动相梯度洗脱配比和流速数据(%)

图1 240 nm处色谱图注:A对照品，B样品，C缺桅子阴性样品;1桅子苷，2黄芩苷

图2 278 nm处色谱图注:A对照品，B样品，C缺黄芩阴性样品;1桅子苷，2黄芩苷

2.4 线性关系考察 分别精密吸取标准品混合溶液 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、30.0 μL，按“2.3”所述色谱条件分别进样分析，记录峰面积，以峰面积积分值Y为纵坐标、进样量X(μg)为横坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，栀子苷回归方程:Y=1 417.7X+81.31，相关系数r=0.999 7(n=7);黄芩苷回归方程:Y=2 580.2X+40.314，相关系数r=0.999 9。结果表明，栀子苷在0.16～2.4 μg范围内线性关系良好，黄芩苷在0.18～2.7 μg范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 分别取同一浓度对照品溶液，按“2.3”所述色谱条件，自动重复进样6次，进样量6 μL，记录色谱图，结果如表3。栀子苷峰面积RSD为0.31%，黄芩苷峰面积RSD为0.19%。表明仪器和方法精密度良好。

2.6 重现性试验 分别精密称取同一批号(MM3112)样品6份，按“2.1.2”样品溶液的制备方法制备溶液。精密吸取制备好的样品溶液6 μL，在“2.3”所述色谱条件下分别进样，记录栀子苷和黄芩苷的峰面积，计算样品含量。结果，栀子苷的 RSD值为0.78%，黄芩苷的 RSD值为0.04%，表明样品和实验方法重复性好。

2.7 稳定性试验 取配置好的同一批号(MM3112)清开灵胶囊样品溶液，室温下放置，分别于制备后 0、2、4、6、8h各进一次样，进样量为6 μL。记录栀子苷和黄芩苷的峰面积，计算栀子苷的RSD值为0.79%，黄芩苷的RSD值为0.04%。结果表明，样品溶液在8h内稳定性良好。

2.8 含量测定 分别取3批不同批号(MM3112、MM3111、MM3113)的清开灵胶囊，样品量分别为0.250 5 g、0.250 9 g、0.250 1 g，去壳研细，按“2.1.2”样品溶液的制备方法制备。样品溶液进样量为6 μL，在“2.3”所述色谱条件下分别进样2次，记录栀子苷和黄芩苷的峰面积，计算每1 g样品中所含栀子苷和黄芩苷的量(mg/g)，结果如表 2所示。

表2 样品含量测定结果

若将含量单位换算为mg/mL，则含栀子苷2.307 0mg/g的样品，含栀子苷的量为0.023 12 mg/mL;含黄芩苷39.154 2 mg/g的样品，含黄芩苷的量为0.392 5 mg/mL。

2.9 加样回收率实验 取已知含量同一批号(MM3112)的样品约0.12 g，精密称定，置25mL量瓶中，按“2.1.2”样品溶液制备方法制备样品溶液，取上述溶液2 mL(含栀子苷0.023 08 mg、黄芩苷约0.391 8 mg)，置10 mL量瓶中，加栀子苷对照品储备液0.2 mL、黄芩苷对照品储备液2.0 mL，加无水甲醇定容。用0.45 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，按“2.3”所述色谱条件测定，进样分析，进样量20 μL，记录峰面积，计算回收率。栀子苷的平均加样回收率为96.94%，RSD为2.08%;黄芩苷的平均加样回收率为100.18%，RSD为2.01%，证明上述方法可靠。

表3 加样回收率实验(n=6)

3 讨论

3.1 流动相的选择 实验过程中选用过很多色谱条件进行预实验，包括乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸水溶液等，但是分离效果都不好，目标成分和其他杂质成分分不开。实验过程中发现，流动相中乙腈的比例越高，洗脱能力越强，对化合物的选择性越高，分离出化合物越精细。但流动相中乙腈的比例过高，会导致样品液中各化合物过早出峰，不能完全分开，因此，只能运用梯度洗脱，通过预实验提高流动相中乙腈的比例，增大流动相流速，使各化合物先后出峰，找到最佳的有效成分分离条件。实验中选择乙腈-0.2%磷酸为流动相，栀子苷保留时间在7.5 min，黄芩苷保留时间在16.0 min。

图3 栀子苷色谱图

3.2 检测波长的选择 检测波长的选择会影响到色谱分析的结果，本实验采用二极管阵列检测器。据二极管阵列检测器吸收光谱图可以看出，栀子苷在240 nm处有最大吸收(见图3)，黄芩苷在275 nm处有最大吸收(见图4)［2］，所以实验中采用240 nm、278 nm为检测波长。

图4 黄芩苷色谱图

3.3 溶剂的选择 栀子苷易溶于水，溶于甲醇;黄芩苷微溶于水，溶于甲醇。实验中分别用30%、50%、70%和100%的甲醇溶液作为溶剂，进行超声提取，分别进样并记录色谱图，发现用70%的甲醇水溶液作为溶剂提取效果较好;黄芩苷在甲醇、水中的溶解度较小［2］，所以在配制黄芩苷标样时浓度不宜太大。

3.4 提取时间的选择 实验时将研细后的药品用70%的甲醇(分析纯)转移，置于25 mL的容量瓶中，分别用超声仪提取20 min、30 min、40 min、60 min。通过比较发现，提取30 min的效果比提取20 min的效果好，和提取40 min效果一样。而提取60 min的样品分离出了太多杂质，影响样品的测定，所以，所有样品均超声提取30 min。

［1］ 张妙媛，姚金成，赵绪元，等.清开灵不同制剂的高效液相指纹特征比较［J］.时珍国医国药，2007，18(2):442-443.

［2］ 国家药典委员会，中华人民共和国药典，2005年版(一部)［S］.北京:化学工业出版社，2000:586，248.