一种适合于PCR扩增的真菌基因组DNA提取方法

李晓倩

(泰山医学院生物科学系，山东 泰安 271016)

药用真菌和药用植物内生真菌作为重要的微生物资源，近年来在抗肿瘤、抗菌、抗病毒［1-2］等方面发挥着越来越重要的作用，现已被广泛应用于生物医药、食品及生物防治等领域。真菌的鉴定工作是真菌资源开发的关键环节。目前，真菌的鉴定仍以形态鉴定为主，但有一些药用真菌形态特征不易辨认或者不易产生子实体，有的药用植物内生真菌在人工培养基中不产孢，这给真菌的分类鉴定工作带来了很大的困难。随着分子生物学技术的不断发展，提取真菌的基因组DNA进行分子鉴定已成为真菌分类鉴定的一种重要方式。核糖体DNA上的内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)是存在于18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA之间的区域，该区域受外界环境因素的影响较小，与编码区域相比具有进化速度快的特点，在种内的不同菌株之间高度保守，而在真菌种间存在极大的变化，表现出极大的序列多态性，可以为真菌学的研究提供丰富的遗传信息［3］，已广泛用于药用真菌如冬虫夏草［4］、金耳［5］等的系统发育以及不产孢植物内生真菌［6-7］的分类鉴定等研究。

优化简便易行的真菌高质量基因组DNA提取方法将会对真菌鉴定工作提供便利。高质量DNA要求高纯度、无蛋白、糖类、酚类、盐类等杂质污染，高分子量、无降解和有一定的数量。药用真菌和药用植物内生真菌的细胞壁都含有复杂的多糖物质、色素以及成分不明的粘稠胞壁物质，这些物质的存在常导致制备的基因组DNA样品中带有不同数量的多糖和其它成分，影响基因组DNA样品的限制性酶切、连接以及PCR反应等操作。本研究采用冷冻干燥菌丝研磨法，并在研磨过程中加入固体形式的聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，然后以高浓度SDS溶液裂解细胞膜，释放DNA，辅以20 mmol/L EDTA洗涤菌丝，有效地去除了DNA中影响后续分子操作的蛋白质、多糖、色素及其它大分子胞壁物质，分离到了高质量的基因组DNA，旨在为泰山药用真菌种质资源保护和系统发育研究以及泰山药用植物内生真菌的多样性和代谢产物研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

泰山灰树花(Grifola frondos)TI 购自泰安农科院食用菌研究所;蛹虫草(Cordyceps militaris)A1 由泰山医学院药物研究所提供;药用植物内生担子菌(plant endophytic Basidiomycetes)F1～F4 本实验室保存菌种。

PVP 上海胜普化工有限公司;SDS 北京拜尔迪生物技术公司;β-巯基乙醇 上海生物工程技术有限公司;5 U/μL Taq DNA 聚合酶、5 mmol/L MgCl2、10× PCR Buffer和10 mmol/L dNTP Takara公司;DL 2000 PCR Marker和溴化乙锭(EB) 宝泰克生物科技有限公司;其它试剂均为国产分析纯。

PTC—100基因扩增仪 MJ公司;AllegraTM64R Centrifuge离心机 Beckman;DYY—Ⅲ型电泳仪和电泳槽 北京六一仪器厂;显微图象分析仪 NIKON，E-50I;QYC-211摇床 上海福玛试验设备有限公司。

马铃薯葡萄糖培养基(PDA)(1L) 马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15g，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 真菌培养与菌丝体收集 将灰树花、蛹虫草和内生真菌活化菌种接种于PDA液体培养基中，28℃、150r/min分别振荡培养至对数生长期。采用真空抽滤法分离菌丝与培养基。菌丝体收集后，依次用无菌生理盐水、20mmol/L EDTA、生理盐水各洗涤一次［8］，然后置于无菌滤纸上，滤纸下铺硅胶，风干菌丝，即可得到干净的菌丝体。

1.2.2 基因组DNA 提取参照程度等［9］采用的SDS法并加以修改，得到改良SDS法。(1)将-20℃冷冻的菌丝0.3 g加入固体形式的PVP(占菌丝量的2%)迅速研磨成粉末;(2)将细粉及时转入50 mL的离心管中，加入10 mL SDS提取缓冲液轻轻旋转混匀;(3)加入1 mL20%SDS(pH7.2)，混匀，65℃水浴保温45 min，间或轻摇混匀;(4)加入5 mL 5 mol/L KAC，混匀后冰浴30 min，10000 r/min、4℃离心10 min;(5)取上清，加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，混匀，10000 r/min、4℃离心10 min;(6)取水相，准确加入0.6倍体积的预冷的异丙醇，轻轻混匀，冰上放置10 min，7000 r/min、4℃离心10 min，沉淀用70%乙醇洗涤，离心后溶于无菌双蒸水中;(7)加入30 μL DNase-free RNase(10 mg/mL)，37℃温育30 min;异丙醇沉淀DNA，70%乙醇洗涤，略风干，溶于TE中，并在-20℃冰箱保存备用。

1.2.3 DNA紫外分光光度计和电泳检测 取DNA样品稀释50倍后，用紫外分光光度计测量A260、A280，根据A260/A280的比值判定DNA的质量。分别取5 μL DNA点样于0.8%的琼脂糖凝胶，5V/cm 稳压电泳1～2 h 后，EB 染色40 min，用水冲净后，用凝胶成像系统保存图像，分别判别DNA 分子的纯度。

1.2.4 ITS序列PCR扩增 采用真菌内转录间隔区通用引物对ITS1/ITS4进行PCR扩增，ITS1和ITS4的序列分别为5?-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3?和5?-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3?。扩增体系为:10 × PCR buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl24 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，5 U/μL TaqDNA 酶 0.5 μL，正反向引物(10 mmol/L ITS1和ITS4)各2 μL，DNA模板4 μL，用ddH2O 补足至50 μL。PCR反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性1 min，55℃复性1 min，72℃延伸1.5 min，，34个循环;然后于72℃延伸10 min。反应结束后，取5 μL PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与讨论

2.1 DNA 提取及检测结果

分别用SDS法和改良SDS法提取了泰山灰树花、蛹虫草和药用植物内生真菌F1～F4的基因组DNA(表1和图1～3)，结果表明，采用SDS法提取两种药用真菌灰树花和蛹虫草DNA，其纯度及产量均较好，但提取4种植物内生担子菌DNA的效果不佳，得到的DNA的A260/A280值为1.4～1.6，均低于1.65，DNA产量均低于70 μg/g湿菌丝;而采用改良SDS法，不管是药用真菌还是植物内生担子菌获得的DNA 颜色均呈白色、A260/A280值为1.8～1.9，DNA 产量为110～170 μg/g湿菌丝。电泳结果显示:用SDS法提取的基因组DNA，点样孔检测到明显的杂质(图1)，说明样品中所含的多糖等杂质较多。另外，蛹虫草基因组DNA还有部分降解(图2)，内生真菌基因组DNA条带不清晰，并有一定程度地弥散(图3)。而采用改良SDS法提取的DNA条带清晰、整齐，无弥散和拖尾现象，无杂质污染，特别是4种药用植物内生担子菌DNA完整，产量和质量得到明显提高。

表1 两种方法提取的真菌DNA的纯度及产率Table 1 The purity and yield of fungal DNAs extracted using conventional and improved SDS methods

图3 两种方法提取4种植物内生担子菌基因组DNA电泳图Fig.3 Electrophoresis of genome DNA extracted from four isolates of plant endophytic Basidiomycetes by two extracting mthods

2.2 ITS序列PCR扩增结果

将改良SDS法提取的灰树花、蛹虫草和植物内生担子菌基因组DNA进行ITS扩增分析，结果见图4～5。PCR结果显示，各真菌rDNA ITS序列多在500～750 bp，两种药用真菌灰树花和蛹虫草PCR扩增条带清晰(图4)，4种植物内生担子菌F1～F4也扩增出较清晰的条带(图5)，说明改良SDS法在提取富含多糖等杂质的真菌DNA时效果良好，可用于rDNA ITS序列分析。

3 讨论

高质量DNA的快速提取是决定分子生物学实验成败的关键因素。真菌DNA提取的诸多方法中，采用SDS法具有安全、价廉、简便、快速等特点，并在实验的操作过程中不需要昂贵的实验仪器和费时的程序。由于药用真菌和植物内生担子菌的细胞壁中含有的多糖物质、色素以及成分不明的粘稠胞壁物质，常规SDS法不能很好地将杂质去除干净，影响后续的分子生物学实验结果。论文在参考前人的工作基础上，采用改良SDS法成功地快速提取了药用真菌和植物内生真菌基因组DNA，关键在于作者对SDS法做了以下几方面改进:

(1)低温干磨，并在研磨过程中加入固体形式的PVP。真菌细胞壁破碎，一般都强调用温和方法，尽量避免机械法，经多次实验表明，低温下研磨省事而无影响，但研磨不要超过10 min，而且要迅速加入裂解缓冲液，否则，研磨过程中释放出蛋白质和DNA酶会降低DNA的提取率。PVP在溶液中有非常良好的浸润能力，在植物DNA的提取中它主要与多酚类化合物结合，避免多酚类化合物介导的DNA降解［10-11］。在本研究中我们借鉴PVP在植物基因组DNA提取中的作用，用于除去真菌中的多酚及成分不明的胞壁物质等杂质，效果良好。

(2)根据高浓度SDS有利于去除多糖［12］这一特点，将SDS浓度提高到20%，结果发现多糖的去除效果很好。

(3)本研究还对温浴时间进行了延长，由原来的30 min改为45 min，并隔一段时间轻摇几下，试验结果表明，该改进使得从真菌材料中提取的DNA纯度有明显的提高。其原因应该是温浴时间加长使得其反应更加彻底，更有利于PVP以及提取缓冲液对于杂质的去除。

(4)研究中我们还发现，供试的植物内生担子菌发酵液特别粘稠，即使加入了酚:氯仿:异戊醇以后，也难以得到清液，加入乙醇沉淀后得到不同程度的白色粘性沉淀，难溶于TE，电泳检测发现含量也较低，可能是因为样品本身含有某种不易去除的胶状物质。通过真空抽滤法收集菌丝，然后用20 mmol/L EDTA洗涤菌丝，有利于去除菌丝中的多糖、色素和其它大分子胞壁物质，再结合改良SDS法可明显提高植物内生真菌基因组DNA的质量，所提取的DNA 能用于PCR 等生物技术领域，适用于药用植物内生真菌的分类鉴定和遗传多样性分析。

［1］ 杨 全，胡旭光，王 琦，等.药用真菌桑黄菌丝体多糖抗肿瘤作用的研究［J］.中国中药杂志，2006，31(20):1713-1715

［2］ 徐丽莉，韩 婷，李 琳，等.人参内生真菌的分离及其体外抗真菌、抗肿瘤活性［J］.2009，30(6):699-702

［3］ 陈庆河，翁启勇，王源超，等.福建省大豆疫病病原鉴定及其核糖体DNA-ITS序列分析［J］植物病理学报，2004，34(2):112-114

［4］ 魏 鑫，印象初，郭英兰，等.冬虫夏草及其相关类群的分子系统学分析［J］.菌物学报，2006，25(2):192-202

［5］ 刘春卉，瞿伟菁，张 雯，等.药用真菌金耳的rDNA ITS序列分析与鉴别［J］.天然产物研究与开发，2007，19:216-220

［6］ 李 伟，纪燕玲，于汉寿，等.中国产禾本科植物内生真菌的遗传多样性及rDNA-ITS 系统发育分析［J］.2006，25(2):217-226

［7］ 范 辉，高晓霞，冯昌文，等.番荔枝科植物鹰爪内生真菌rDNA ITS-PCR扩增条件的优化［J］.西北农业学报，2008，17(5):61-64

［8］ 吴志红，汪天虹，黄 卫，等.简便易行的丝状真菌染色体DNA提取法［J］.菌物系统，2001，20(4):575-577

［9］ 程 度，黄翔宇，李宝健.药用真菌高质量总DNA的制备及基因组文库的构建［J］.菌物系统，2002，21(1):137-139

［10］ Green M J，Thompson D A，Mackenzie D J.Easy and efficient DNA extraction from woody plants for the detection of phytoplasmas by polymerase chain reaction［J］.Plant Disea，1999，83:482-485

［11］ Li JT，Yang J，Chen DC，et al.An optimized mini-preparation method to obtain high-quality genomic DNA from mature leaves of sunflower［J］.Genet Mol Res，2007，6(4):1064-1066

［12］ 徐 芳，王丽萍，陈 波，等.改良SDS法快速提取赤芍干叶片DNA 的研究［J］.中草药，2009，40(4):571-573