高效液相色谱法同时测定糕点中4种防腐剂

赵质创，杨建英，姚庆伟，郑晓冰，施 煜

（汕头市质量计量监督检测所，广东 汕头 515041）

0 引 言

糕点是人们喜爱的传统食品，但易霉变，保质期较短，厂商为了延长其保质期，提高经济效益，常使用苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸和富马酸二甲酯等防腐剂，但这些防腐剂对人体健康有不同程度的危害。目前，我国GB 2760-2007《食品添加剂使用卫生标准》明确规定了糕点类食品中防腐剂的使用种类和限量标准，因此，建立快速、同时检测多种防腐剂的方法对于食品行业的监管意义重大。

目前，关于测定食品中防腐剂的研究方法很多，多采用液相色谱法和气相色谱法，但大多数均需分类测定[1-4]，且前处理过程也较为繁琐[4-10]，尚没有同时检测防腐剂（苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、富马酸二甲酯）的报道。常见的防腐剂测定前处理方法是采用提取溶剂反复提取后沉淀蛋白质纯化或固相萃取纯化[1-2，5-7]，该方法操作较为繁杂；张莉等[8]、辛若竹等[9]采用透析净化技术对提取样液进行纯化，纯化效果较好，但耗时费力，不利于日常的快速检测；谢丽琪等[10]、韩惠雯等[4]研究了采用提取溶剂提取后调节提取液至中性的前处理方法，提取步骤较为简便。该文对糕点类食品中常见的4种防腐剂进行了同时测定，以建立糕点类食品常用防腐剂的快速准确检测技术，满足实际应用要求。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

甲醇：色谱纯；富马酸二甲酯：sigma公司；苯甲酸、山梨酸标准溶液（1.00mg/mL）：国家标准物质研究中心；脱氢乙酸：美国Supelco公司。

标准储备液：称取100mg脱氢乙酸，用10mL 20g/L的氢氧化钠溶液溶解后，用水定容于100mL的容量瓶中；称取富马酸二甲酯100mg用甲醇溶解并定容至100mL的容量瓶中，配制成浓度为1mg/mL的标准储备液，贮存于0～4℃冰箱中。

混合标准溶液：分别吸取1 mL脱氢乙酸储备液、富马酸二甲酯储备液以及苯甲酸、山梨酸标准溶液于25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成0.04 mg/mL的混合标准溶液。

乙酸铵溶液：称取1.55g乙酸铵，用水溶解并定容至1000mL。

氨化甲醇：量取5mL氨水于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

Agilent1200高效液相色谱仪（配有二极管阵列检测器DAD）；超声波水浴器由上海科导超声仪器有限公司生产；无机滤膜（聚醚砜）和有机滤膜（尼龙）规格为13mm×0.45μm，由上海安谱科学仪器有限公司生产。

1.2 色谱条件

色谱柱为Diamonsil C-18柱（250 mm×46 mm，5 μm）；流动相A为甲醇，流动相B为乙酸铵溶液，洗脱条件见表1；流速为1.0 mL/min；柱温40℃；进样量为10μL。

表1 HPLC梯度洗脱条件

1.3 实验方法

1.3.1 标准曲线的制备

将混合标准溶液用纯水稀释配制成浓度为1，2，4，8，16μg/mL 的标准混合溶液，进液相色谱分析，以各标准峰的保留时间定性，峰面积外标法定量，绘制标准曲线。

1.3.2 样品前处理方法的优化

分别用甲醇、氨化甲醇、水、80%甲醇和20%甲醇作为提取溶剂，分别称取5份2.000～5.000g粉碎的加标面包样品于5支50 mL带刻度具塞比色管中，加入提取溶剂定容至50mL，加塞混和后置于超声波水浴中处理15min，经0.45μm滤膜过滤后，进样测定。

1.3.3 精密度和加标回收率测定

选取面包、蛋糕、馅料3种样品，进行3水平添加回收试验，每个添加水平取6个平行样，进行回收率试验。

1.3.4 方法最低检出限

选取空白样品添加标准溶液，添加浓度依次降低，对每个浓度样品测定3次，记录每次测得的信号强度S与背景信号强度N，取S和N均值，以能达到S/N≥3时样品的浓度为方法的最低检出限。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

分别取苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、富马酸二甲酯浓度为0.04mg/mL的溶液，在200～400nm波长范围内扫描。结果显示苯甲酸、山梨酸在230 nm处有强吸收，脱氢乙酸在225 nm波长处有强吸收，在290 nm波长处有次强吸收，富马酸二甲酯在210nm处有强吸收，故选择检测波长为220nm。

2.2 线性关系

将浓度为 1，2，4，8，16μg/mL 的混合标准溶液，在规定的色谱条件下进行测定，8μg/mL混合标准溶液的高效液相色谱图见图1，系列标准溶液所得的色谱峰峰面积和对应的浓度绘制成标准曲线，得到的线性方程见表2。各组分线性关系良好，符合定量要求。

表2 4种防腐剂标准曲线方程

2.3 样品前处理方法的优化

由于4种防腐剂在水溶液及甲醇溶液中的溶解性能各不相同，该研究分别用甲醇、氨化甲醇、水、80%甲醇和20%甲醇作为提取溶剂对加标样品进行前处理，测定其回收率。结果见表3，加标回收试验显示氨化甲醇难以提取脱氢乙酸，而水对富马酸二甲酯的提取效果较差，甲醇、80%甲醇和20%甲醇均可较好地提取4种组分，均能满足检测要求，尤以20%甲醇作为提取溶剂各组分提取效果最好，同时在液相色谱上也有很好的分离效果。

表3 4种防腐剂不同提取溶剂的回收率

2.4 精密度、加标回收率和最低检出限

表4 面包样品添加不同浓度混合标样的回收率及相对标准偏差

表5 蛋糕样品添加不同浓度混合标样的回收率及相对标准偏差

表6 月饼样品添加不同浓度混合标样的回收率及相对标准偏差

根据添加低浓度加标样品，以3倍信噪比值算出各组分的检出限。结果见表4，表5，表6，加标回收率为84%～106%，相对标准偏差（RSD）为1.13%～4.54%，各组分检出限均为0.5mg/kg。加标样品色谱图见图2，图3，图4，回收率较高，精密度较高，准确度和精密度符合实际样品的检测要求。

3 结束语

该文采用了甲醇、氨化甲醇、水、80%甲醇和20%甲醇作为提取溶剂进行试验。结果表明，氨化甲醇难以提取脱氢乙酸，而水难以提取出富马酸二甲酯，甲醇、80%甲醇和20%甲醇溶液可以同时提取4种组分，尤以20%甲醇作为提取溶剂可保证4种组分同时被最高效率地提取，且在液相色谱上有很好的分离效果。此前处理方法简便，相比谢丽琪等[10]、韩惠雯等[4]的研究前处理需要调节pH等步骤更为简便。

从精密度、回收率和最低检出限试验中表明，该检测方法灵敏度、精密度和准确度均较高，符合检测要求。试验证明，该方法一次性同时测定糕点中常见4种防腐剂，提取步骤简便快速，方法符合检测要求，可以用于日常糕点类食品中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸和富马酸二甲酯的同时测定。

[1] GB/T 5009.29—2003食品中山梨酸、苯甲酸的测定[S].北京：中国标准出版社，2004.

[2]GB/T 5009.121—2003食品中脱氢乙酸的测定[S].北京：中国标准出版社，2004.

[3]NY/T 1723—2009食品中富马酸二甲酯的测定高效液相色谱法[S].北京：中国农业出版社，2009.

[4] 韩惠雯，黄菲菲，赵嘉胤，等.高效液相色谱法测定食品中的富马酸二甲酯的研究[J].上海农业学报，2009，25（3）：72-74.

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[6] 吴玉娟.固相萃取-液相色谱法测定糕点中脱氢乙酸、苯甲酸、山梨酸的方法研究[J].福建分析测试学，2007，16（4）：33-36.

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[8] 张莉，张英宣.高效液相色谱法测定糕点类食品中的防腐剂、甜味剂[J].石河子大学学报：自然科学版，2004，22（3）：210.

[9] 辛若竹，丁梅，郑贤光，等.气相色谱法测定面包、糕点、酱等食品中复合防腐剂及甜蜜素[J].卫生研究，2008，37（4）：498-501.

[10]谢丽琪，郑卫平，岳真峰，等.高效液相色谱法测定焙烤食品中糖精钠、富马酸二甲酯、苯甲酸和山梨酸[J].检验检疫科学，2002，12（6）：30-31.