5种棘豆总黄酮含量的测定比较

刘 璐，付明哲，王 侠，赵宝玉

(1.西北农林科技大学理学院,陕西 杨凌 712100； 2.西北农林科技大学动物医学院，陕西 杨凌 712700; 3.咸阳市渭城区畜牧局,陕西 咸阳 712000)

棘豆属(Oxytropis)植物为豆科植物，广泛分布在我国西北、华北、西南等地，许多品种是蒙药、藏药的重要药材。黄酮类化合物是其主要的药用成分，迄今为止，已从该属植物中分离得到黄酮类及其衍生物64个，其中黄酮17个，黄酮醇39个，异黄酮1个，异黄烷1个，二氢黄酮1个，查耳酮4个，二氢查耳酮1个[1]。许多研究表明，黄酮类化合物具有多种生物活性，在抗氧化、抗癌、抑制脂肪酶等方面有显著效果，已被广泛应用于医药领域[2-4]。黄酮类化合物的定量分析最常用的方法为液相色谱法和分光光度法。液相色谱法仪器昂贵，标准对照品不易获得，常用于黄酮单体定量测定；紫外可见分光光度法操作简单方便，标准对照品易得，结果准确。目前，关于棘豆属植物总黄酮含量的分光光度法测定已有零星报道，刘妍等[5]用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法测定了多叶棘豆(O.myriophylla)中总黄酮的含量;杨光明和王栋[6]用同样的方法测定了镰形棘豆(O.falcata)中总黄酮的含量。本研究在参考植物黄酮含量紫外分光光度测定方法的基础上，用紫外分光光度法测定了棘豆总黄酮含量，旨在为棘豆属植物黄酮类化合物的进一步开发和应用提供借鉴。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1样品及处理 样品甘肃棘豆(O.kansuensis)、黄花棘豆(O.ochrocephala)、小花棘豆(O.glabra)、冰川棘豆(O.glocialis)和急弯棘豆(O.deflixa)均由西北农林科技大学动物医学院临床兽医系提供。样品经阴干、去杂、粉碎，过0.50 mm筛备用。

1.1.2主要试剂 芦丁为对照品(中国药品生物品检定所，批号10080-200306)。三氯化铝、石油醚、甲醇、无水乙醇等均为国产分析纯。

1.1.3主要仪器 TG328A分析天平(上海精密科学仪器有限公司生产)、D754紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂生产)、旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司生产)、KQ-1500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司生产)、SHZ-III循环真空泵(上海亚荣生化仪器厂生产)和TU-1901紫外光谱仪(普析通用仪器有限责任公司生产)。

1.2方法

1.2.1棘豆总黄酮的提取 称取6 g(平行3份)经粉碎过筛预处理棘豆干粉，按1∶10的料液比加入体积分数为60%的乙醇，在超声频率20 kHz、功率800 W，超声温度45 ℃条件下，提取45 min，过滤得滤液，再次超声波处理，过滤。合并两次滤液，抽滤，浓缩，用石油醚萃取，除去石油醚部分，将乙醇部分转移到100 mL容量瓶，用甲醇定溶，作为样品提取液。

1.2.2棘豆总黄酮类化合物的显色反应[7-8]

(1)醋酸镁显色反应

在层析纸上滴加1滴浓缩的乙醇提取液，喷1%醋酸镁甲醇溶液，干燥，紫外分光光度计365 nm下观察纸斑的颜色变化。

(2)铅盐沉淀反应

吸取1 mL的乙醇提取液置于试管中，加2滴2%醋酸铅溶液，观察变化。

(3)盐酸-镁粉反应

吸取1 mL乙醇提取液置于试管中，加2滴浓盐酸，再加镁粉少许，观察颜色变化。

(4)与碱液反应

吸取1 mL的乙醇提取液置于试管中，加入10% NaOH溶液5滴，观察颜色变化。

(5)硅胶G薄层色谱法

取浓缩的乙醇溶液，点于硅胶薄层板上，以氯仿∶甲醇(9∶1)展开，取出，晾干。再喷以5%三氯化铝乙醇溶液，在紫外光灯下观察。

1.2.3棘豆总黄酮的含量测定 利用黄酮类化合物结构上的酚羟基及其还原性羰基能够与铝盐试剂形成有色络合物，以芦丁为对照品，采用紫外分光光度法测定不同品种棘豆总黄酮含量[7]。

对照品溶液的制备：准确称取在120 ℃干燥至恒质量的芦丁23.1 mg于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度线，摇匀，作为对照品溶液。

最大吸收峰的确定：样品和芦丁通过三氯化铝显色后，用扫描型紫外分光光度计在200～700 nm对其进行扫描，通过对比芦丁标准品及样品的特征吸收曲线，判断是否能用芦丁作标准品。

标准曲线的绘制：精确吸取0.542 mg/mL芦丁标准液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50 mL于8只10 mL容量瓶中，加入1 mL 1%三氯化铝甲醇液，用甲醇定容，摇匀，放置15 min，以不加芦丁标准液为空白，于274 nm波长下测定吸光度。每个样品设置3个平行样。以吸光度对芦丁含量作标准曲线。

2 结果与分析

2.1棘豆总黄酮类化合物的颜色反应 分别对5种棘豆属植物黄酮类化合物进行醋酸镁反应、铅盐沉淀反应、盐酸-镁粉反应、碱液反应及硅胶G薄层色谱5种颜色反应，鉴别结果见表1。供试样品乙醇提取液均含有黄酮类化合物，其中甘肃棘豆、急弯棘豆及冰川棘豆的5种颜色反应均呈阳性，而黄花棘豆除碱液反应呈现阴性外，其他4种反应均呈阳性，小花棘豆除盐酸-镁粉反应呈阴性外，其他4种反应均呈阳性。

表1 5种棘豆属植物中黄酮类化合物的鉴别结果

2.2棘豆与芦丁对照品的紫外吸收光度 棘豆乙醇提取液与标准样品芦丁分别于200～700 nm波长处扫描(图1)，乙醇提取产物与芦丁在274 nm均处有紫外光谱特征峰，因此可用芦丁作为标准品进行测定。

图1 芦丁、棘豆乙醇提取物紫外吸收光谱图

2.3棘豆总黄酮含量测定 5种棘豆的平均总黄酮含量由高到低的顺序依次为甘肃棘豆、小花棘豆、急弯棘豆、黄花棘豆及冰川棘豆，其中甘肃棘豆平均总黄酮含量显著高于小花棘豆、急弯棘豆、黄花棘豆，极显著高于冰川棘豆，冰川棘豆总黄酮含量最低(表2)。

3 讨论与结论

黄酮类化合物是棘豆属植物的主要药用成分，黄酮类化合物在其基本碳架上含有碱性氧原子，而绝大多数都是带有酚羟基的衍生物，因而能与某些金属离子产生络合反应，和某些较强的还原剂发生颜色反应。盐酸-镁粉反应发现反应溶液由黄色逐渐变成红色，说明棘豆含有黄酮类化合物[9]。醋酸镁和三氯化铝与双氢黄酮作用后，在紫外光下可呈现显著的天蓝色荧光和蓝绿色荧光，而其他黄酮类化合物则呈黄色，表明棘豆含有双氢黄酮类化合物。黄酮化合物与铅盐反应会生成黄色或红色沉淀[10]，色泽因羟基数目及位置不同而异。棘豆样品与铅盐反应有黄色沉淀生成，表明该提取物分子结构中极有可能含有邻二酚羟基，3-羟基、4-酮基或5-羟基的黄酮类化合物。

紫外分光光度法是应用黄酮类化合物含有α-苯基色原酮基结构，以及羟基与2个芳香环形成的2个共轭系统，对紫外光有2个相应区域特征吸收，多采用在碱性介质中加铝盐显色的分光光度法。三氯化铝显色法依据三氯化铝能与黄酮A环或B环上的邻二酚羟基作用生成红色络合物，还可与具有3-羟基、4-酮基或5-羟基的黄酮醇类化合物作用生成络合物，在274 nm 处形成新的吸收峰[11-12]。本研究表明，三氯化铝显色后，芦丁和样品在274 nm处有最大吸收峰，且完全重合，因此选择芦丁为测定时的标准品，274 nm作为最大吸收波长。本研究采用石油醚萃取，减少色素对结果的干扰，使测定结果更加准确。石油醚提取液的黄酮定性反应为阴性，不会造成黄酮损失。

棘豆属植物黄酮类化合物在长期的生态适应过程中为抵御恶劣生态条件、动物、微生物等攻击而形成的一大类低分子量的多酚类次生代谢产物[13]，植物次生代谢产物的生成受遗传和环境的影响较大[14]，尽管不同品种棘豆属植物中所含化学成分大致相同，但生长环境不同导致黄酮的含量不一。

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