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重组免疫毒素EGF-TCSredlk治疗实体肿瘤实验研究

2011-04-25,,

长春中医药大学学报 2011年5期
关键词:切片肝癌小鼠

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(解放军总医院中医研究所,北京 100853)

重组免疫毒素治疗肿瘤的基本原理是寻找一种对肿瘤细胞有专一行亲和能力的“生物导弹”,近年来利用基因工程技术构建了不同用途的免疫毒素[1-2]。研究表明,免疫毒素分子量更小、更易渗透至肿瘤组织、不容易产生抗体,但机体对毒素蛋白部分仍会产生免疫反应,有人认为短期大量用药会减少这一毒副作用。此外,肿瘤细胞表面存在的特异性靶抗原是导向治疗的前提,在体内具有靶向性,更易于与肿瘤细胞结合,对正常细胞的毒副作用很小,有很高的抑瘤率。在我国肝癌的发病率很高,长期以来一直缺乏十分有效的治疗方法,应用免疫毒素治疗肝癌不失为一种有益的尝试。本实验室已成功地制备了新型免疫毒素EGF-TCSredlk,本实验以荷人肝癌裸鼠为模型,观察其在体内对荷瘤小鼠的抑瘤效果,为肿瘤的治疗提供了一条新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 重组免疫毒素EGF-TCSredlk由本实验室制备、保存;RPMI-1640培养基购自GIBCO公司;新生牛血清购自杭州四季青生物制品公司;DAB显色剂、vWA兔多抗购自Dako公司;其余试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞株及培养 肝癌BEL-7402细胞株购自北京协和药物研究所,用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基培养、传代,采取贴壁细胞培养法,在5%CO2、37 ℃孵箱中培养。

1.3 实验动物 裸鼠20只,体质量(20±2)g,雌雄各半。购自军事医学科学院实验动物中心,分笼饲养,自由摄食、饮水。在清洁级实验动物饲养中心内饲养。

1.4 荷肝癌裸鼠动物模型的建立 体外培养生长活跃的肝癌BEL-7402细胞经胰酶消化、收集并离心,用PBS配成1×107/mL单细胞悬液,分别以0.2 mL/只的剂量接种于饲养的裸鼠右腋皮下。约5 d左右即可见肿瘤生长。待肿瘤长至0.3 cm×0.3 cm时开始实验。

1.5 分组及给药 将20只小鼠随机分成4组,对照组和治疗组,每组5只,经尾静脉给予治疗组注射不同剂量的免疫毒素EGF-TCSredlk,治疗Ⅰ组、治疗Ⅱ组和治疗Ⅲ组剂量分别为25、50和100 μg/kg,对照组给予注射相同体积的生理盐水。每日1次,连续7 d。

1.6 小鼠体内抑瘤实验 停药1 d后处死小鼠,剥离瘤体,称瘤重,计算抑瘤率。肿瘤抑制率按以下公式计算:肿瘤抑制率=[(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100%。

1.7 肿瘤的病理变化观察 按EnVisionTM试剂盒(丹麦DAKO基因公司)说明操作如下:1)石蜡切片脱蜡和水化后,用PBS(pH 7.4)冲洗3次,每次3 min。2)对组织抗原进行高压修复。3)每张切片加50 μL 3%过氧化氢阻断溶液(试剂A),室温下孵育10 min,以阻断内源性过氧化酶的活性。PBS冲洗3次,每次3 min。4)除去PBS液,每张切片加50 μL正常非免疫动物血清(试剂B),室温下孵育10 min。5)除去血清,每张切片加50 μL第一抗体,4 ℃过夜。6)PBS冲洗3次,每次3~5 min。除去PBS液,每张切片加50 μL生物素标记的第二抗体(试剂C),室温下孵育30 min。PBS冲洗3次,每次3 min。7)除去PBS液,每张切片加50 μL链霉菌抗生素-过氧化氢酶溶液(试剂D),室温下孵育10 min。PBS冲洗3次,每次3 min。8)除去PBS液,每张切片加100 μL新鲜配制的二氨基联苯胺(DAB)溶液,显微镜下观察3~10 min。9)自来水冲洗,苏木素复染,氨水返篮。10)切片常规梯度乙醇(70%、80%、90%乙醇5 min各1次,95%乙醇5 min 2次,100%乙醇5 min 3次)脱水之后,二甲苯透明,50%中性树胶封片。一抗工作浓度:vWA抗体(1∶200),微波炉中进行抗原修复,DAB显色,苏木精复染。电镜观察组织结构变化。

2 结果

2.1 EGF-TCSredlk对荷人肝癌小鼠体内抑瘤实验结果 模型组平均瘤重(6.04±1.06)g,治疗Ⅰ组平均瘤重(3.90±0.32)g,治疗Ⅱ组平均瘤重(2.75±0.32)g,治疗Ⅲ组平均瘤重(1.48±0.21)g,(Welch=82.617,P=0.000),组间比较采用Tambane’s T2法,3组分别与对照组相比,有统计学意义(P<0.05);各组相比有统计学意义(P<0.01)。3组抑瘤率分别为35.4%、54.5%、及75.5%。

2.2 肿瘤组织病理变化 成瘤组织经HE病理切片示,瘤细胞弥漫浸润成分单一,大小形态一致,瘤细胞呈圆形或卵圆形,细胞核卵圆形或不规则形,核仁明显较大,核分离相多见,胞浆少或中等量。治疗各组较对照组有更多的肿瘤坏死区(见图1)。

3 讨论

本实验在体外培养生长活跃的肝癌BEL-7402细胞经胰酶消化、收集并离心,用PBS配成1×107/mL的单细胞悬液,分别以0.2 mL/只的剂量接种于饲养的20只裸鼠右腋皮下,约5 d左右均见肿瘤生长,成功建立了肝癌移植瘤动物模型。在实验中选用EGF-TCSredlk25、50、100 μg/kg 3种剂量和同等体积生理盐水对荷人肝癌裸小鼠进行尾静脉注射给药体内试验。从瘤重和抑癌率两方面对EGF-TCSredlk抑癌作用进行评估。在瘤重方面,EGF-TCSredlk与模型组对抑制裸鼠实体瘤生长有显著性差异(P=0.000)。25 μg/kg EGF-TCSredlk治疗组与模型组对抑制裸鼠实体瘤的生长没有差异,50、100 μg/kg EGF-TCSredlk治疗组与模型组对抑制裸鼠实体瘤的生长差异有统计学意义

A

B

C

D

(P<0.05),瘤重减轻程度与剂量相关。低、中、高剂量组的抑制率分别为35.4%、54.5%及75.5%。按国家药物试验标准药物的肿瘤抑制率>30%时,视为有效。本实验EGF-TCSredlk剂量为25、50、100 μg/kg时抑瘤率均>30%,表明免疫毒素EGF-TCSredlk具有良好的体内抑瘤作用。而其他的以EGFR为靶点的药物,如EGFR单抗,治疗剂量为10 mg/kg,是EGF-TCSredlk的200倍,并且没有明显的抑瘤率,只能用小鼠的生存时间来说明药效[4-7];肿瘤学病理研究[8]表明,如果肿瘤周围没有新生血管的生长、癌细胞生长及增殖在达到数微米体积时就会自身消亡。抗血管生成的目的在于损坏现有的肿瘤血管,阻止肿瘤的生长,抑制新的肿瘤血管形成。肿瘤组织免疫组化结果显示EGF-TCSredlk可以明显的抑制肿瘤血管的形成,高剂量组肿瘤组织未有可见血管,中低剂量组肿瘤组织血管明显少于模型组,其抑制肿瘤生长、转移的途径可能是通过抑制肿瘤血管生长来抑制肿瘤生长及转移[8]。为肿瘤的治疗提供一条新的思路。

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