1株犬源致病性黑曲霉菌的分子鉴定及生物学特性研究

李必富，王晓佳，杨金福，汤 承

(西南民族大学生命科学与技术学院，动物医学四川省高等院校重点建设实验室，四川成都610041)

犬皮肤真菌病是寄生于犬被毛与表皮、趾爪角质蛋白组织中的真菌引起的以皮肤瘙痒、红斑性脱毛、丘疹、脓包、结痂、皮屑等为特征的各种皮肤病.它是一种人畜共患病，可通过直接和间接接触传播给人类.近年来中国宠物犬的饲养数量大幅增加，犬源皮肤真菌通过接触感染人的机会大大增加，犬已经成为人真菌病的重要传染源.宠物病原真菌主要是小孢子属和毛癣菌属成员［1］，目前国内报道犬的真菌性皮肤病中丝状真菌的感染率最高，其病原体70%是犬小孢子菌，20%是石膏样小孢子菌，10%是须发毛癣菌［2］，尚未见致病性黑曲霉菌的研究报告.国内目前对动物病原真菌的鉴定主要是采用分离培养及形态学鉴定，但该方法对形态相近的真菌难以准确鉴别，而分子鉴定则显示出其巨大的优势.真菌在rDNA-ITSA区段既具有保守性，又在属间及种间存在广泛的多态性，利用这一特性进行PCR扩增及序列分析已经广泛应用于动植物病原真菌鉴定.作者从皮肤病患犬病灶中分离出一株真菌，经核糖体转录间隔区(rDNA-ITS)基因克隆测序鉴定为黑曲霉，并对其培养特性、耐药性及致病性等生物学特性进行了研究，为犬源真菌病的诊疗提供参考.

1 材料与方法

1.1 临床病例和小鼠

2岁棕色雄性贵宾犬，表现为皮肤瘙痒，背部和尾部脱毛、皮肤出现红色丘疹.成年雄性昆明鼠购自四川大学实验动物中心.

1.2 培养基和试剂

PCR Master Mix购自天根生物有限公司;JM109感受态细胞购自奥克公司;PMD19载体购自日本TaKaRa公司;胶回收试剂盒购自天根生物有限公司.地塞米松由郑州卓峰制药厂生产，沙堡培养基和两性霉素B、伊曲康唑胶囊、酮康唑、制霉菌素、氟康唑等5种抗真菌药敏纸片购自杭州微生物制品有限公司.

1.3 引物

参照文献［3］设计的位于18 S区域的上游引物和文献［4］设计的位于28 S区域的下游引物，扩增包含真菌 rDNA 18 S和28 S的部分区域和ITS1，5.8 S，ITS2 的完整区域的片段，上下游引物序列为:5’-tccgtaggtgaacctgcgc-3’，5’-tcctccgcttattgatatgc-3’，引物由上海生物工程公司合成.

1.4 真菌分离培养及形态学观察

将患部用酒精仔细清洁消毒后用刀片刮取患部皮屑和组织，接种于沙堡平板培养基，37℃培养1周，观察菌落特征，并将分离出的真菌采用载片培养，37℃培养72 h，观察菌体形态.

1.5 ITS区的PCR扩增

收集沙堡平板72 h真菌培养物，加入液氮研磨，用酚-氯仿法提取真菌总DNA，进行ITS区的PCR 扩增.体系:PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各 1 μL，DNA 模版1 μL，无菌水补足至25μL.扩增反应条件为:95℃ 7 min，95 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min 30 s，35 个循环;72℃10 min;16℃保存;结束反应.PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统成像观察电泳结果.

1.6 克隆测序及系统发育分析

按照胶回收试剂盒说明书将扩增片段进行纯化，连接T载体并转入JM109感受态细胞，阳性克隆送上海英俊公司测序.用DNAStar 7.1.0版DNA分析软件中的MegAlign软件对ITS区基因序列进行同源性比较和系统发育分析，自举值为1 000.

1.7 药敏试验

将孢子浓度为1×106CFU·mL-1的真菌涂布于沙堡平板培养基，并将药敏片平贴于培养基上，37℃培养48 h，测定抑菌圈大小，并按照说明书提供的标准判断其对药物的敏感性(表1).

表1 抑菌圈判定标准Table1 Interpretation of the standard zone of inhibition

1.8 致病性试验

参照文献［5，6］报道的方法，12只小鼠首先肌肉注射地塞米松，0.2 g·只-1，连续注射8 d，使小鼠处于免疫抑制状态.随后将小鼠分为3组，每组3只，第1组经腹腔注射途径感染，5×105CFU·只-1，第2组经皮肤感染，具体做法是首先将小鼠背部刮毛，大小约为2 cm2，再用刀片刮无毛区皮肤至轻微破损，立即用蘸取真菌孢子的棉签涂抹，5×105CFU·只-1，第3，4组以生理盐水代替真菌孢子分别经腹腔和皮肤进行处理，作为空白对照组.隔离饲养于SPF鼠笼中，观察记录小鼠的临床症状及病理变化至第4周，并于试验结束后扑杀小鼠，观察皮肤及内脏病变，采集病料进行真菌分离培养.

2 结果与分析

2.1 真菌的分离培养及形态特性

在沙堡琼脂平板上37℃ 24 h可见白色绒毛状菌落，以后迅速蔓延，菌丝体为白色，48 h达到孢子成熟阶段，随着孢子的形成而逐渐变为中央呈黑色厚绒状菌落，中心可见孢子形成的黑色颗粒，有环状沟纹;载片培养物镜检可见菌丝发达而多分枝，顶端可见大球型顶囊，分生孢子头呈黑褐色放射状宛若“菊花”(图1)，为典型的黑曲霉菌落及形态特征.

图1 黑曲霉的菌落及菌体特征Fig.1 The colony and morphological characteristics of Aspergillus niger

2.2 r DNA-ITS区的鉴定结果

从真菌分离株(SC-8)中扩增出1条约600 bp的条带(图2)，测序结果显示扩增片段大小为599 bp，与GenBank中的黑曲霉ITS区基因序列的同源性为94.1% ～100%(图3)，是黑曲霉的特异片段，证实分离菌株为黑曲霉(Aspergillus niger SC-8).

系统发育分析表明，Aspergillus niger SC-8和巴西人源分离株(FJ810501)以及意大利人源分离株(GQ359407)聚为1支(图4).

2.3 药敏试验结果

Aspergillus niger SC-8对两性霉素和制霉菌素高度敏感，对酮康唑中度敏感，而对氟康唑和伊曲康唑耐药.

图2 真菌分离株的PCR鉴定结果Fig.2 The results of PCR identification of Aspergillus niger

2.4 致病性

以生理盐水处理的小鼠在试验期间精神、食欲正常，被毛光顺，皮肤出现瘙痒和红肿现象.而经皮肤和经腹腔感染小鼠各有1只出现皮肤瘙痒、发红、渗出和脱毛现象，与犬自然感染病变相似(图5).剖检可见该小鼠脾脏有白色霉菌结节(图6)，从该部位和患部皮肤均分离出真菌，经PCR扩增和测序证实为黑曲霉.

3 讨论

本研究从皮肤病患犬分离出真菌，经过rDNAITS基因序列测定和动物试验，确诊该犬的皮肤病是由黑曲霉引起的.曲霉菌感染可引起人和动物的浅部真菌病［7］，ELAD 等［7］还发现土曲美可引起犬的弥散性真菌病.而深部感染的报道并不多见，国内尚未见黑曲霉感染犬的报道.真菌多为条件性致病菌，常于机体免疫功能低下时继发感染或与其他病原混合感染，加重病情，增加死亡率.近年来，中国人和动物的免疫缺陷性疾病发病率不断升高，随着中国宠物养殖数量的不断增长，犬只与人类的接触更为密切，感染人的机会大大增大，犬已经成为人类真菌性皮肤病的重要传染来源.本研究发现犬源黑曲霉rDNA-ITS基因与人源黑曲霉具有高度的同源性，且对制霉菌素和两性霉素具有耐药性，其公共卫生学意义值得关注.

基于ITS间隔区的片段序列扩增及序列测定可准确鉴定动物病原真菌.西南民族大学动物医学四川省高等院校重点建设实验室通过对不同研究报告中的上下游引物序列进行优化组合，扩增真菌rDNA-ITS区约599 bp的片段，通过测序和序列分析，将该实验室分离的41株犬源皮肤真菌分为15个属，16个真菌小种，其中3株为黑曲霉菌［8］.证明基于ITS区序列的分子鉴定技术对犬源真菌的鉴定广泛适用.

［1］ 于 湘，周德壮，林宏亮，等.浅谈犬真菌病与螨虫病的鉴别诊断［J］.湖北畜牧兽医，2010(3):27-28.

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［3］ GARDESM，BRUNST D.ITSprimer with enhanceds specificity for basidiomycetes:application to the identification of mycorrizae-andrusts［J］.Mol Ecol，1993(2):113-118.

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［5］ 李 杰，施文琴，林德贵.犬小孢子菌感染豚鼠皮肤引起的郎格罕氏细胞的变化［J］.中国兽医杂志，2007，43(11):27-28.

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［8］ 王晓佳.真菌DNA提取方法研究和犬源真菌分子鉴定［D］.成都:西南民族大学，2007.