玉米非编码RNA Zm-1701在逆境胁迫下的表达研究

刘铁梅，刘宗才，李丹丹，高美娟，张 琨，阚云超，李春奇

(1.河南农业大学生命科学学院，河南郑州450002;2.南阳师范学院河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室，河南南阳473061)

逆境胁迫是作物生长和产量提高的重要限制性因素之一.水资源匮乏造成的干旱是粮食生产中突出的问题.中国的耕地约800万hm2有不同程度的盐渍化，也成为提高粮食产量的限制因素［1］.玉米是中国重要的粮食作物，也是对盐和干旱胁迫较敏感的植物，深入开展玉米的抗逆境胁迫机制研究，不仅对探索植物抗性的分子机制有重要的理论意义，而且对提高玉米产量也有重要的应用价值.

非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)是广泛存在于细胞内不编码蛋白质的RNA的总称，目前在 http://www.noncode.org/index.htm 网站公布的数据中，初步统计出的非编码RNA序列大概有212，527条，涵盖861个物种，包括了病毒和类病毒等物种.这些非编码RNA通过各种各样的方式，在转录或转录后水平上对靶基因进行调控，参与到生物生长发育过程中［2］.目前，研究最多的是microRNA，这些小分子RNA通过与靶基因互补配对等方式造成靶基因降解或翻译抑制来调控靶基因的表达.如在拟南芥中发现的小分子 RNA miR160，它能够通过调控 ARF10，ARF16，ARF17 基因的表达参与到生长激素信号传导过程中［3，4］;研究发现，植物在受到逆境胁迫时，会诱导或抑制体内某些非编码RNA的表达来应对胁迫，JIAN等［5］发现拟南芥在受寒害胁迫时，miR319c会被大量诱导表达，而 miR393，miR395，miR397b和 miR402 的表达能够受到干旱或盐分胁迫的影响;同时，过表达植物体内存在的某些小分子RNA也会使植物产生一系列的生理生化反应.如过表达miR398会导致Cu/Zn超氧化物歧化酶CSD1和CSD2的mRNA生成减少;反之，过表达抗miR398的CSD2能够提高植物对强光、重金属等逆境的抗性，说明miR398在植物抗强光和重金属胁迫过程中发挥着负向的调控作用［6］.除了这些小分子ncRNA，生物体内还存在着为数众多的长片段ncRNA.而且随着研究的深入，人们发现这些长片段ncRNA在生物生长发育过程中发挥着更广泛的调控作用.如最近在玉米中鉴定出1种花粉特异性表达的长片段ncRNA Zm-401，能够参与小孢子和花粉壁的形成.抑制或者过表达该ncRNA基因都会导致玉米小孢子空瘪、变形，无内容物，绒毡层出现退化延迟，使花粉形态异常，甚至导致雄性不育［7］.在前期实验的基础上，对筛选到的1个外显子起源的长片段ncRNA在干旱和盐胁迫条件下的表达情况进行了初步研究，以期从非编码RNA的角度探索植物响应逆境胁迫的分子调控机制.

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试玉米品种为Ch7-2，由河南农业大学农学院提供.

1.2 玉米培养及取样方法

玉米种子用质量分数为1%HgCl2消毒5 min，蒸馏水冲洗4次，28℃暗处浸种12 h，暗处催芽48 h，移至1×Hoagland营养液中培养至3叶期(温度28℃，湿度70%，光照/黑暗时间为14 h/10 h)，分别用20%PEG6000 处理 1，2，6 h;100 μmol·L-1ABA处理3，6，24 h;150 mmol·L-1NaCl处理 1，3，6，12，24，48 h;未处理的幼苗作对照，取玉米根，用DEPC水冲洗，吸水纸吸干后于液氮中保存备用.

1.3 试剂及仪器

1.3.1 试剂 PEG6000(Ameresco)，ABA(Sigma)，NaCl(Sigma)，Trizol(Invitrogen)，Northern Blot相关试剂购自Roche公司.

1.3.2 仪器 电泳仪(美国Bio-rad)，半干转膜仪(美国 Bio-rad)，紫外交联仪(法国，BLX-E254)，杂交炉(Thermo-Election)，低温离心机(德国，Eppendorf)，凝胶成像系统(美国，Bio-rad)，PCR 仪(美国，MJ)

1.4 试验方法

1.4.1 玉米根总RNA提取 Trizol法提取玉米根的总RNA.

1.4.2 半定量RT-PCR 通过查阅文献资料，确定玉米的盐胁迫、干旱胁迫和ABA胁迫的响应基因:DREB2A(GenBank:AB218833.1)［8］，dbf1(Gen-Bank:AF493800.1)［9］，dhn1(NCBI Reference Sequence:NM_001111949.1)［9，10］.取不同处理玉米根的总RNA 2μg，按照Promega公司AMV反转录试剂盒说明书进行cDNA第1链的合成，PCR引物如表1所示.

表1 半定量RT-PCR所用引物Table1 Primer sets for Semi-quantitative RT-PCR

1.4.3 Northern杂交 根据实验室前期试验结果得到在玉米根中表达的非编码RNA Zm-1701;克隆入pGEM-4Z载体，体外转录合成RNA探针(地高辛标记).取各个处理时间点的玉米根总RNA 2μg，6% 变性PAGE电泳后，转至带正电的尼龙膜上，68℃杂交过夜，X光片采集杂交信号.

2 结果与分析

2.1 Zm-1701的发现及序列分析

在构建玉米非编码RNA cDNA文库的过程中，发现1个由基因GRMZM2G555972外显子转录产生的ncRNA Zm-1701，经Northern验证后确定该RNA确实为真实存在的非编码RNA，而不是mRNA降解产物.Zm-1701长162 nt，位于玉米第9条染色体上，其宿主基因 GRMZM2G555972，全长1 011 bp，编码1个58 aa的功能未知蛋白，具体结构特征还不清楚(见Maizesequence.org).用mfold对Zm-1701的2级结构进行预测，结果如图1所示，该RNA 2级结构接近1个H/ACA box snoRNA，但是进一步分析发现，Zm-1701不具有典型的H box和ACA box，且在玉米中没有明显的靶标，不能指导rRNA，snRNA或tRNA的假尿嘧啶化修饰，所以属于不能归类的 ncRNA.其宿主基因GRMZM2G555972编码玉米中1个未知的蛋白，且基因内部存在1个Ac转座子插入位点，位于Zm-1701基因上游.

图1 Zm-1701的2级结构预测Fig.1 Putative secondary structure of Zm-1701

2.2 Zm-1701在3种胁迫条件下的表达

玉米中存在着大量可移动的遗传元件—转座子Ac(Activator)，一定的胁迫条件可以激活植物基因组中本来处于休眠状态的转座子，激活的转座子会导致基因组和生物性状的不稳定，但在特定条件下有利于生物体产生遗传变异来应对胁迫［11］.Zm-1701基因的上游存在着Ac转座子插入元件，因此推测该ncRNA可能参与玉米的逆境应答反应.为了进一步验证Zm-1701的功能，对3叶期的玉米实施一定的逆境处理，用PEG6000和ABA模拟干旱胁迫，用高浓度的NaCl模拟盐胁迫，选择对胁迫敏感的组织-根作为研究对象，利用前人研究结果中得到的胁迫效应基因DREB2A，dbf1，dhn1来确定胁迫的具体作用时间.3个基因的半定量RT-PCR结果如图2所示，图A表明，在PEG6000浓度为20%，处理时间为1 h时，dbf1基因开始大量表达，到6 h后开始下降，说明PEG6000处理1 h后玉米根中干旱胁迫响应基因大量表达.图B显示在ABA浓度为100μmol·L-1，处理时间为3 h时，dhn1基因开始大量表达，随后逐渐增多，到24 h后仍无下降趋势，说明ABA处理3 h后胁迫响应机制开始启动.图C显示在150 mmol·L-1NaCl处理3 h后，DREB2A基因表达量开始上升，至24 h后逐渐下降，表明NaCl处理3 h后，玉米根中盐胁迫效应机制启动.

Zm-1701在3种胁迫条件下的表达情况如图3所示.Zm-1701在正常生长条件下都有表达，PEG6000处理后，表达量逐渐增多，6 h时被大量诱导(图3-A).ABA胁迫的结果和PEG6000相似，随着处理时间的延长，Zm-1701的表达量逐渐升高，但其效应灵敏性不及PEG6000，24 h时才被大量诱导表达(图3-B).Zm-1701对盐胁迫反应比较灵敏，NaCl处理后3 h，它的表达量已明显增加，但随后又呈下降趋势(图3-C).

图2 3个胁迫响应基因半定量RT-PCR结果Fig.2 Semi-quantitative RT-PCR results of three stress response genes

图3 3种胁迫条件下Zm-1701 Northern杂交结果Fig.3 Expression results of Zm-1701 under 3 stresses by Northern blot

3 讨论

在构建了玉米非编码RNA cDNA文库的基础上，发现了1个从基因外显子序列上转录产生的ncRNA，该RNA位于1个Ac转座子插入位点的下游.转座子是植物中大量存在的可移动转座元件，在植物基因组的改造和突变过程中发挥着重要作用，植物在受到外界逆境胁迫时，能够激活自身基因组中处于休眠状态的转座子［11，12］.殷文超等［13］发现，在NO胁迫产生的水稻突变株中，转座子mPing发生转座激活.HE等［14］研究发现，接种水稻稻瘟病病菌后，水稻内源CACTA类转座子Rim2转录活性增加.TANISAKA［15］和 TSUGANE［16］发现水稻材料在受到γ-射线辐照后转座子mPing和nDart1被激活.本研究发现，位于Ac转座子下游的ncRNA Zm-1701，在玉米受到干旱或盐胁迫时被诱导大量表达，其是否作为Ac转座子的一部分参与玉米逆境信号响应过程中还需要进一步的研究.

植物的生长过程常受到许多不良环境的影响，在长期的进化过程中，植物为了适应环境逐渐建立了自身的适应和抗性机制.干旱、高温、盐渍等逆境严重影响了植物的生长，当植物受到胁迫时体内会产生一系列生理、生化反应，许多胁迫响应基因被诱导表达.近年来，随着分子生物学的快速发展，人们对植物响应逆境胁迫机制的认识逐渐加深，许多相关基因及一些转录因子被相继鉴定、克隆［17～20］.从非编码RNA角度研究植物的逆境响应机制的报道大都集中在 miRNA 方面［5，6，21～24］，对中等长度片段ncRNA调控植物发育的机制的研究还很少.从长片段ncRNA的角度研究非编码RNA参与植物逆境响应的调控机制，有可能为玉米转基因改良提供一定的理论依据.

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