母体血浆游离HLCS基因用于无创伤性产前诊断DS的研究

王凤双,王淑秋

(佳木斯大学基础医学院,黑龙江佳木斯 154007)

唐氏综合征,又名21三体或先天愚型,属于常染色体遗传病。有三种分型:游离型、异位型和嵌合型。三种分型临床表现严重程度不一样,但是通常都表现出智力低下、特殊面容、不育、身材矮小、颈椎脆弱、常伴有先天性心脏病或其他器官畸形。DS患儿的出生为患者个人、家庭、社会造成沉重的经济负担和强大精神压力。再者,DS患儿的出生率较高,是常见的非整倍体遗传病之一,引起全世界的普遍关注。目前临床上能够做的就是康复性训练,但效果不佳。所以进行产前诊断,预防此类患儿的出生时目前解决这一问题的最好手段,实践证明也是有效的。

1 材料与方法

1.1 实验材料

QIAmp DNA Blood Mini Kit,Blood Genome DNA Extraction Kit,Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0,PrimeSTAR○HS DNA Polymerase,BstUI内切酶,引物,硼酸,EDTA,T ris-base,无水乙醇。

1.2 实验方法

随机选取2008—09～2011—03来我院进行产前诊断的健康孕妇20例,孕周 12～15周,年龄22～34岁,每例孕妇采取外周血3.0mL;DS孕妇7例,孕周12～18周,年龄25～36岁,采取外周血3.0mL。另外采取一名非足月终止妊娠的DS患儿绒毛膜组织,提取DNA,作为阳性对照,无菌蒸馏水作为空白对照。根据胎儿来源和母体来源的HLCS和RASSF1的甲基化程度不同,提取DNA经甲基化敏感性内切酶BstUI消化后,PCR扩增,比较健康和DS孕妇HLCS的相对剂量大小。本实验提前征得实验参与人员或家属知情同意,保证研究结果对外保密。

1.3 统计学处理

实验所得计量资料用采用SPSS15.0软件进行Mann-Whitney U分析,P＜0.05有显著性意义。

2 结果

2.1 BstUI酶切后PCR结果

见图1,2。

图1 M 为100bp Marker,1为DS孕妇血浆样本,2为DS孕妇外周血样本,3为健康孕妇血浆样本,4为健康孕妇外周血样本,5为DS阳性对照,6为空白对照。130bp的是 RASSF1的PCR产物,96bp的是HLCS的PCR产物。

2.2 健康和DS孕妇血浆中HLCS/RASSF1的剂量变化

经统计学分析P＜0.01,两组间HLCS相对剂量差异显著。

3 讨论

已经有不少文献报道了孕妇外周血血浆或血清中非细胞游离胎儿DNA(cell free fetal DNA,cffDNA)的存在[1,2]。实质上孕妇外周血血浆中的游离DNA包括两部分:妊娠期间胎儿和母体非细胞游离DNA均可以在母体外周血中检测到,且胎儿DNA可以在妊娠32天的血浆中检测到。cffDNA较容易提取,利用荧光定量PCR技术可以较容易的定量。众多周知,非细胞游离胎儿DNA是以片段的形式存在,且短于母体起源的DNA片段。除此之外,还可以肯定的是胎儿DNA存在于破裂的凋亡小体的核小体中。母体外周血中cffDNA的浓度随妊娠期的增加而增加。孕早期时cffDNA的水平每周增长约21%,孕中期时达到峰值,分娩前急剧上升。健康孕妇分娩后16～30min后,cffDNA迅速消失。这一快速转变表明胎儿DNA进入母体血浆循环是持续的,为胎儿DNA产生、清除提供了实时画面。因此cffDNA是一种妊娠的生物标记物。通过母体血浆核酸分析检测DS主要有两类方法。第一类包括胎儿特异性核酸标记物[3]SNPs等位基因比例的分析。这类方法的例子包括胎盘来源mRNA的分析(RNA-SNP法)[4]和DNA甲基化标记物分析(表观遗传学等位基因比例法)。等位基因比例分析的主要不足之处在于这种方法只适用于胎儿该位点是杂合子的情况。第二类方法是利用单核酸分子计数法,例如数字化PCR和大量平行基因组测序[5,6]。在这些方法中,个体血浆DNA分子数目测定出来。这些方法的准确性可以检测到孕妇血浆中DS引起的胎盘起源DNA分子的微量上调。后种方法的一个不足之处在于大量分子的计数需要胎儿非特异性的标记物,例如21号染色体的随机序列,不足之处在于需要昂贵的试剂盒设备以及相对复杂的生物信息学手段。Yu K.Tong.等[7]在一系列胎儿起源的血浆游离DNA甲基化筛查中发现了HLCS基因调控区是高度甲基化的,而相反的是母体来源的血浆HLCS基因调控区是非甲基化的。这就为分离胎儿来源的母体血浆HLCS DNA提供了途径,为基于CFF-DNA的产前诊断提供了有一条线索。我们利用甲基化敏感性内切酶BstUI,识别CGCG序列,如果该位点有甲基化,则切不断该序列,如果改位点没有甲基化,则该序列被切断。所有样本经BstUI酶切后,进行 HLCS PCR扩增,由于母源血浆游离 HLCS基因片段是非甲基化的,所以在BstUI酶切过程中被切断,而胎儿来源的被保留下来。酶切是否完全由β-actin PCR扩增结果来验证。酶切完全时,β-actin PCR不会出现预期结果,相反的话就是酶切不完全。本实验结果证明DS孕妇血浆HLCS基因片段拷贝数和健康孕妇血浆HLCS基因片段拷贝数的差别具有显著意义(P＜0.01),HLCS基因可以成为未来无创伤性产前诊断的潜在标记物。由于本实验样本量不够大,且指标单一,基因拷贝数计算方法不够尖端,所以胎儿来源血浆游离甲基化基因片段用于产前诊断需要广泛、且深入的研究。另外CFFDNA用于产前诊断具有几大优势:①无创伤性;②周期短,一边核型分析至少需要2周时间;③可以做到早期产前诊断;④经济成本低,操作便捷。总之,CFF-DNA用于产前诊断前景光明。

[1]Wright CF,Burton H.The use of cell-free fetal nucleic acids in maternal blood for non-invasive prenatal diagnosis[J].Hum Reprod Update,2009,15:139-151

[2]Lo YM,Tein M S,Lau TK,et al.Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum:implications for noninvasive prenatal diagnosis[J].Am J Hum Genet,1998,62:768-775

[3]Lo YMD,Chiu RWK.Prenatal diag nosis:prog ress through plasma nucleic acids[J].Nat Rev Genet,2007,8:71-77

[4]Lo YMD,T sui NBY,Chiu RWK,et al.Plasma placental RNA allelic ratio permits noninvasive prenatal chromosomal aneuploidy detection[J].Nat Med,2007,13:218-223

[5]Lo YMD,Lun FMF,Chan KCA,et al.Digital PCR for the molecular detection of fetal chromosomal aneuploidy[J].Proc Natl A cad Sci U S A,2007,104:13116-13121

[6]Fan HC,Blumenfeld YJ,Chitkara U,et al.Noninvasive diag nosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105:16266-16271

[7]Tong YK,Ding C,Chiu R W K,et al.Noninvasive prenatal detection of fetal trisomy 18 by epigenetic allelic ratio analysis in maternal plasma:theoretical and empirical considerations[J].Clin Chem,2006,52:2194-2202