多柔比星肾病大鼠IL-18、IFN-γ及IL-4的表达及意义

王丽敏,张静,罗巧华

(佳木斯大学附属第一医院儿科,黑龙江佳木斯 154003)

微小病变型肾病综合征(minimal change nephritic syndrome,MCNS)是儿童原发肾病综合征中最常见的病理类型,其发病机制目前尚不甚明了,多年来大部分MCNS患儿临床上以糖皮质激素及环磷酰胺为代表的免疫抑制疗法能够有效控制肾病的发展,改善患者临床症状,但同时也产生了很多副作用。因此,在严格掌握免疫抑制治疗适应证的同时,我们应该探求新的更安全的治疗方法。近年来辅助性T淋巴细胞亚群功能失衡与MCNS相互关系日益为人们重视。而白细胞介素18(IL-18)作为一种新发现的炎性因子,其与辅助性T淋巴细胞亚群功能的相关性也倍受关注。最近的研究亦发现MCNS患者血及尿中IL-18水平持续升高,提示IL-18在MCNS发病中起重要作用。因此,我们在多柔比星肾病模型中,测定血清和肾组织中Th1相关的IL-18及IFN-γ和 Th2相关的 IL-4的水平变化,初步探讨多柔比星肾病大鼠IL-18、IFN-γ及 IL-4的表达及意义以寻求防治MCNS的新方法。

1 材料与方法

1.1 材料

86只雄性Wistar大鼠,清洁级,体重(100±20)g,由佳木斯大学实验动物中心提供。注射用盐酸多柔比星(浙江海正药业股份有限公司生产);大鼠 IL-18、IFN-γ及 IL-4ELISA试剂盒(美国 R&D生物公司生产)。

1.2 模型制备及分组

大鼠随机分二组:正常组,模型组。正常组40只,肾病组大鼠46只。注射用多柔比星10毫克/支,用生理盐水稀释为2mg/mL溶液,在非麻醉状态下将大鼠固定于固定器中,参照王峥等[1]方法将肾病组一次性尾静脉注射多柔比星5mg/kg,注射后第7天收集所有大鼠24h尿液,进行24h尿蛋白定量,尿蛋白＞30mg/24h为模型成功,不符合者3只予以剔除。实验过程中,模型组大鼠共死亡3只,正常组无死亡。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 标本留取及细胞因子测定

实验第7、14、28、42天将各组大鼠在乙醚浅麻醉下摘眼球采血5mL,分离血清、剖腹取肾,将右侧肾组织匀浆后离心,取上清液 3mL,均置于-20℃冰箱保存以备做IL-18、IFN-γ、及IL-4的检测。左侧肾组织用10%甲醛固定,常规石蜡包埋后,切片进行HE染色观察肾组织变化。

1.3.2 24h尿蛋白检测

分别在多柔比星注射后 6、13、27、41d将大鼠单独喂养在代谢笼中,自由饮水,收集 24h尿液,记录24h尿量。用全自动生化分析仪检测24h尿蛋白定量。

1.3.3 血生化检测

于实验第42天乙醚麻醉大鼠,处死前摘眼球采血采血3mL,在离心机中离心取血清,用全自动生化分析仪检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 尿蛋白变化

模型组第7天大鼠出现蛋白尿,以后进行性升高。模型组24h尿蛋白定量较正常组明显升高,呈现大量蛋白尿(P＜0.01)第42天尿蛋白量达高峰。见表1。

2.2 血生化指标

第42天模型组血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)显著高于正常组(P＜0.01);总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)显著低于正常组(P＜0.01);尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)含量各组间无显著性差异(P＞0.05)。见表2。

表1 各组大鼠24h尿蛋白测定(mg/24h,± s,n=10)

表1 各组大鼠24h尿蛋白测定(mg/24h,± s,n=10)

注:与正常组比较★ P＜0.01;与模型组比较◆P＜0.01。

______分组 7d 14d 28d 42d正常组 5.99±0.72 5.96±0.78 6.06±0.72 5.94±0.76_____模型组 52.5±4.27★ 129.61±6.67★____________________________________________________________________________________________________________________250.38±11.55★_286.19±13.7★

表2 各组大鼠血清 T C、TG、ALb、TP、BUN、SCr水平(± s,n=10)

表2 各组大鼠血清 T C、TG、ALb、TP、BUN、SCr水平(± s,n=10)

注:与模型组比较★ P＜0.01。BUN和SCr含量各组间无显著性差异(P＞0.05)。

____分组 TC(mmol/L)_________TG(mmol/L) A Lb(g/L) TP(g/L) BUN(μ mol/L) SCr(mmol/L)正常组 0.83±0.21★ 0.69±0.09★ 32.42±2.59★ 57.23±0.72★ 6.32±0.1 17.06±0.86___模型组_____________3.39±0.75________________2.2±0.03_____________________________________________________________________________________20.13±1.78_32.39±0.86_7.82±0.16_18.78±1.27

表3 各组大鼠血清及肾组织IL—18的水平(±s,pg/mL,n=10)

表3 各组大鼠血清及肾组织IL—18的水平(±s,pg/mL,n=10)

注:与正常组比较★P＜0.01;与正常组比较☆P＜0.01。

组别 血清IL-18肾组织IL-18正常组 模型组 正常组 模型组7d 260.25±8.09 387.20±12.96★ 320.71±12.29 421.75±5.18☆14d 254.69±11.66 526.79±40.10★ 310.03±6.98 589.50±13.66☆28d 261.54±8.12 750.38±43.80★ 319.96±9.44 809.09±16.28☆_____42d 253.59±9.50 871.35±14.82★_____________________________________________________________________________________________________________320.54±10.57_922.09±7.50☆

2.3 血清及肾组织细胞因子测定

2.3.1 血清及肾组织中IL-18、IFN-γ的表达

与正常组比较,模型组各期血清及肾组织中 IL-18、IFN-γ水平均升高(P＜0.01)。见表 3、表4。

2.3.2 血清及肾组织中IL-4的表达

与正常组比较,模型组各期血清及肾组织中IL-4水平均有所下降(P＜0.01)。见表5。

表4 各组大鼠血清及肾组织IFN—γ的水平(± s,pg/mL,n=10)

表4 各组大鼠血清及肾组织IFN—γ的水平(± s,pg/mL,n=10)

注:与正常组比较★ P＜0.01;与正常组比较☆P＜0.01。

组别 血清IFN-γ肾组织IFN-γ正常组 模型组 正常组 模型组7d 81.45±3.29 96.45±3.30★ 120.22±6.20 237.84±4.35☆14d 83.78±4.35 115.66±4.99★ 124.83±4.20 268.98±4.94☆28d 85.66±4.46 126.18±15.85★ 130.59±5.22 283.83±6.43☆_____42d 85.41±2.23 131.17±5.33★ 126.43±4.55_____________341.17±7.14☆

表5 各组大鼠血清及肾组织血清IL—4的水平(±s,pg/mL,n=10)

表5 各组大鼠血清及肾组织血清IL—4的水平(±s,pg/mL,n=10)

注:与正常组比较★ P＜0.01;与正常组比较☆P＜0.01。

组别 血清IL-4肾组织IL-4正常组 模型组 正常组 模型组7d 15.20±1.46 63.68±3.27★ 40.26±3.46 124.69±6.26☆14d 14.21±0.84 62.81±5.31★ 38.85±3.01 113.33±6.14☆28d 15.42±1.35 57.18±2.73★ 41.72±3.52 100.20±5.37☆_____42d 14.55±1.21 52.11±3.61★ 39.68±3.64______________90.80±5.20☆

3 讨论

MCNS是一类以炎症反应为主的自身免疫性疾病,有多种细胞因子参与其免疫病理过程,最近的研究表明,T细胞介导的免疫反应失衡牵涉到MCNS的发病。IL-18是一种强有力的免疫调节因子,它对多种细胞尤其免疫细胞有多向性作用,它具有强烈的促炎症作用,它可以显著刺激Th1细胞产生IFN-γ、IL-2等细胞因子,且活性高于IL-12,能与IL-12协同作用但又不互相依赖。IL-18同样可以显著增强抗CD3单抗、ConA和IL-2活化的外周血单个核细胞产生IFN-γ的活性,同时也可促进GM-CSF分泌,抑制IL-4、IL-10产生。同时临床研究发现NS患者血和尿中IL-18水平异常增高,且与本病的临床经过平行相关。此外抑制IL-18释放可以明显降低VPF的合成。已证实VPF与NS蛋白尿的发生密切相关[2]。本试验发现血清和肾脏IL-18和IFN-γ水平越高,尿蛋白就越重,说明 IL-18和IFN-γ的异常表达及量的增多与蛋白尿的发生、发展密切相关。且IL-18及以Th1型为主的免疫失衡在MCNS发病中起重要作用。另外本研究显示模型组血清及肾组织中IL-18水平显著增高,且与IFN-γ水平呈正相关,而IL-4水平明显降低。提示在MCNS发病过程中血清及肾组织IL-18增高促进了辅助性T淋巴细胞亚群平衡偏移,表现为Th1细胞活性升高,这可能是其发病机制之一。现代免疫学认为在不同的抗原、细胞因子或抗原递呈细胞(APC)等因素作用下,可使 Th0细胞向Th1或Th2转化或Th1细胞与Th2细胞之间发生转化[3]。Th1以分泌IL-2、IL-12、INF-γ、TNF-α等促炎症因子为主。Th2以分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等抗炎症因子为主,其中 IL-4 和IFN-γ是维持Th1/Th2细胞比例的关键分子,IL-4对Th0细胞分化为Th1和 Th2起关键性调控作用。且IL-4是主要的Th2细胞因子[4],故试验中常常检测 IFN-γ和 IL-4来分别代表Th1和Th2的功能状态。这两类辅助性T细胞之间的动态平衡对维持机体正常的免疫功能起重要作用。Daniel[5]等人的实验证实,儿童原发性肾病在发病期是以Th1细胞活化,而长期缓解期是以Th2细胞活化,Th1功能下调为特征的。Matsumoto[6]推测活动期MCN患者体内存在Th1细胞功能亢进/Th2细胞功能低下的紊乱模式。在本研究中,我们检测不同时期模型组大鼠血清和肾组织中IL-18、IFN-γ和 IL-4,结果显示不同时期模型组血清及肾组织中IL-18和IFN-γ水平显著升高,而IL-4降低,这与Daniel等观点一致。提示Th1/Th2失衡与MCNS发病相关,并且这种失衡与IL-18水平变化相关。

本实验较好的模拟了人类的MCNS,从细胞因子的角度研究检测了各个时期MCNS大鼠血清及肾组织中IL-18、IFN-γ和IL-4的水平。结果表明模型组血清及肾组织IL-18、IFN-γ水平与正常组相比也明显升高,且IL-18、IFN-γ水平与24h尿蛋白定量之间呈显著正相关,与相关报道一致。因此抑制或中和内源性IL-18的释放及活性,纠正失衡的Th1/Th2有可能成为MCNS治疗的新途径。

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