5-Aza-2dc通过表观修饰对Naive T细胞诱导的研究

何 敏,卢思广

(1.徐州医学院,江苏徐州 221002;2.徐州医学院附属连云港第一人民医院儿科,江苏连云港 222000)

30多年前,研究者发现了大量具有解除特异抗原的免疫应答的淋巴细胞。在1975年,这些细胞被命名为抑制细胞,即目前的 T reg细胞,它可抑制器官移植的排斥反应[1]。Treg细胞表面高表达CD25,而胞内Foxp3基因是其一个相对特异标志和功能分子,高表达Foxp3基因的Treg细胞对于维持免疫系统的内环境的稳定和预防自身免疫疾病有极其重要的作用[2]。而Foxp3基因的稳定表达可通过表观修饰方式调节,如组蛋白及DNA修饰。在Treg细胞中,foxp3启动子区的CPG模体几乎完全去甲基化,显示稳定的Foxp3的表达,而CD4+CD25-T细胞正好相反[3,4]。目前,5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-2dc)是研究最多的去甲基化药物,它能够逆转基因的甲基化状态,从而恢复基因的表达水平。近年来,国内外对组蛋白去乙酰化抑制酶试剂(如TSA)通过表观修饰研究较多,但使用DNA甲基化酶抑制剂5-Aza-2dc诱导Treg细胞研究较少,特别是这种药物对Treg细胞表型维持的研究。本研究中,用5-Aza-2dc试剂使DNA去甲基化,促进特异基因Foxp3的表达,并可使CD4+CD25-T细胞转化为CD4+CD25+T细胞,从而为稳定与预防自身免疫疾病提供新的思路与方法。

1 材料与方法

1.1 材料

PHA(美国Sigma);人Treg分选试剂盒和MACS分选器(德国Miltenyi);MTT试剂(美国Sigma);5-Aza-2d(美国Sigma);人淋巴细胞分离液(加拿大Cedarlane);酶标仪(美国BIO-RAD)。

1.2 方法

1.2.1 PHA最佳浓度的摸索

用含10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液调整PBMC密度至 1×106/mL,并加入不同终浓度PHA(0μ g/mL、μ g/mL、7.5μ g/mL 、10μ g/mL 、12.5μ g/mL),每个浓度设置 5个复孔,置37℃、5%CO2条件下培养 68h,然后加入 MT T继续培养 0h、2h、4h、6h,在倒置显微镜下观察细胞的显色,分别上酶标仪波长450nm,参考波长650nm,检测各孔细胞光密度值(OD值),确定最佳的检测时间和刺激浓度。

1.2.2 CD4+CD25+T细胞的分离及纯度鉴定

采集100mL新鲜外周血(自愿献血的健康人)使用Fillcon密度梯度离心法分离人 PBMC,参照美天旎 CD4+CD25+T reg细胞的免疫磁珠分选试剂盒说明书,获得阴选CD4+CD25-T细胞,阳选CD4+CD25+T reg细胞(即 nT-reg)。分别取少量分选所得细胞,加入抗CD4/抗CD25荧光抗体,避光孵育15min,PBS缓冲液洗涤一次,加PBS重悬,然后上流式细胞仪(FCM)检测纯度。

1.2.3 分选细胞活性及计数检测

利用台盼蓝染色法评价淋巴细胞活性,取0.1mL细胞悬液,加等量的0.4%台盼蓝溶液,充分混匀,染色2min。取上述细胞悬液少许滴在盖玻片上或下侧的计数板凹足曹处流出悬液,至盖玻片被液体充满为止。置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。计数其中蓝染的细胞。结果显示正常细胞不着色,死细胞被染成蓝色。细胞活力及密度按下列公式计算:细胞活力(%)=(总细胞数-着色细胞数)÷总细胞数×100%;细胞密度=(4个大格细胞总数/4)×104/mL

1.2.4 制备抗原提呈细胞

使用含10%胎牛血清的RPMI 1640细胞培养液调整部分CD4+CD25-T细胞密度至 1×107/mL,加入终浓度25μ g/mL的丝裂霉素 C,置 37℃,5%CO2条件下培养30min,使用RPMI 1640清洗 3次,并调整细胞密度至1×106/mL备用。

1.2.5 数据整理

使用SPSS v13.0统计软件进行分析,各组计量资料以(± s)表示,各组进行比较前先进行正态性及方差齐性检验,多组间比较采用单因素方差分析,α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 免疫磁珠分选的结果

分选前PBM C活力为(95.63±1.80)%,分选后 CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+T细胞活力分别为(95.70±1.50)%和(93.60±2.16)%,分选前后细胞活力比较无明显差异(P＞0.05)。

2.2 不同浓度5-Aza-2dc对Naive T细胞的诱导

实验中我们把三种不同浓度5-Aza-2dc处理后,Naive T细胞受到不同程度的诱导,且浓度在 100μ g时,诱导率最高。见表1。

2.3 在不同处理时间下,对Naive T细胞的诱导

根据上述结果,在5-Aza-2dc浓度为100ng/mL时,使用不同时间进行诱导,用流式细胞仪检测膜标志CD25的表达。结果显示,药物处理后72h,Treg细胞比例最大。见表2。

表1 不同浓度5-Aza-2dc对Naive T细胞的影响(n=5)

表2 5-Aza-2dc不同处理时间下对细胞诱导的影响(n=5)

3 讨论

Treg细胞在体内仅占外周CD4+T细胞的5%～10%,绝对数量极少,在抗原的刺激下,自身又很难扩增和增殖,因此,本实验选择Naive T细胞作为研究对象,此类细胞并非终末期细胞,通过不同药物诱导分化这类细胞成目的细胞。5-Aza-2dc作为一种嘧啶核苷类似物,在DNA复制过程中与甲基转移酶(DNMT)结合形成一种共价复合物,抑制该酶的甲基转移活性,从而达到去甲基化,使多种因甲基化而失活的基因重新表达,恢复基因的功能,促使细胞的转化。在本研究中,该药物可以促使Naive T细胞内的Foxp3基因重新表达,而Foxp3基因是T reg细胞的相对特异的标志和功能分子,故可诱导Naive T细胞转化为Treg细胞,研究结果显示,在培养第24小时后,T reg细胞数明显上升,72h膜标志CD25含量最高,而接下来的继续培养中或撤离药物,随着时间延长,Treg细胞的比例逐渐减少,因此,5-Aza-2dc只能短暂地维持细胞的表型稳定。如能成功实现对Treg细胞表型的长期稳定,将可上调细胞的数量和功能,达到治疗自身免疫性疾病的作用。

[1]Kilshaw PJ,Brent L,Pinto M.Suppressor T cells in mice made unresponsive to skin allografts[J].Nature,1975,255:489

[2]Brunkow M E,Jeffery EW,Hjerrild KA,et al.Disruption of a new foxk-head/helix protein,scurfin,results in the fatal lymphoproliferactive disorder of the scurfy mouse[J].Nat Genet,2001,27(1):68-73

[3]Janson PC,Winerdal M E,Marits P,et al.FOXP3 promoter demethy lation reveals the committed Treg population in humans[J].P LoS one,2008,3(2):1612

[4]Zinner R,Albiezl H,Walter J,et al.Histone lysine methylation patterns in human cell types are arranged in distinct three dimensional nuclear zones[J].Histochem Cell Biol,2006,125(1-2):3-19