生物大分子超微结构研究中的原子力显微术

朱杰 郭连红 张诗音 王霖 王国栋

(1. 西北农林科技大学 理学院 生物物理研究所 心血管再生研究组，陕西 杨凌712100;2. 吉林大学 超分子结构与材料国家重点实验室，吉林 长春 130012;3. 西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌712100;4. 中南大学 公共卫生学院，湖南 长沙 410078；5. 西北农林科技大学 创新实验学院，陕西 杨凌712100)

前言

1986年，斯坦福大学的Binnig G等人发明的原子力显微镜 (Atomic Force Microscope, AFM)的放大倍数}远远超过以往的任何显微镜[1]。光学显微镜(Optical Microscopy, OM)的放大极限仅为103倍，电子显微镜(Electronic Microscopy，SEM/TEM)的放大极限也只有106倍，而AFM的放大极限则高达109倍，在观察生物大分子的结构上具有很大的优势。另外，作为目前生物医学超微结构研究最常用的工具，SEM/TEM成像要求对生物样品进行固定、脱水、包埋、切片、染色或镀金等一系列繁琐处理；而AFM 则可在大气或溶液中直接观测生物样品及其动态变化过程。除此以外，AFM通过控制并检测针尖--样品之间的相互作用力，可以分析研究与作用力相应的各种表面性质：采用最新的Tapping技术和Phase技术可以测试样品的硬度和弹性等力学特性；AFM可对生物大分子进行力学操作。总体上，AFM拥有原子级的高分辨率，可以观察活的生物样品，能够对样品进行力学操纵，这些特性使AFM在生物大分子超微结构与生物力学研究中具有广泛的应用前景。

1.AFM在生物大分子超微结构研究中的应用

(1)蛋白分子：由于膜蛋白结构的复杂性和研究条件不成熟等因素，以前对膜蛋白结构的认识较少，AFM的出现为膜蛋白结构的认识提供了先进手段。蛋白质分子在脂膜上有规律地排列甚至形成二维晶体，均适合于用AFM研究[2]。低信噪比的AFM可用来来检测膜蛋白的原子结构，高信噪比的AFM则可直接对膜蛋白在纳米级分辨率清晰成像；特殊信噪比的AFM可使膜蛋白在接近生理状态下成像，水平分辨率达到0.5～1nm。垂直分辨率可达0.1～0.2 nm。随着AFM探针技术的发展，最近对蛋白的研究已达到可以同时对多种参数进行计量和测算的程度。游离蛋白不易在载体上被固定，其成像质量往往不及膜蛋白，但AFM还是能够比较成功地观察肌动蛋白、血纤维蛋白原、免疫球蛋白等游离蛋白分子。如对肌动蛋白的观察，早期用AFM获得的图像中可看到5 nm高隆起的肌动蛋白分子结构，随着探针技术的不断发展，逐步观测到了肌动蛋白分子的螺旋构造，现今用轻敲模式不仅观测到70nm长的D带区，就连区内的亚结构也能观察。通过AFM对肌动蛋白聚合、解聚、破裂、弹性系数变化等过程的观察，证实了肌动蛋白的网络结构对活细胞稳定性的决定作用。

(2)脱氧核糖核酸：自从Lindsay等首次用AFM获得脱氧核糖核酸的图像以来，AFM已经成为研究核酸分子结构的重要工具[3]。Bustamante等用AFM在室温和干燥空气条件下得到质粒DNA的图像，可以清晰地观测到三维环状DNA分子的结构，并可估算分子的宽度和高度[4]。Claudio等观察了在不同的湿度下DNA构型的变化,如A-型、B-构型、Z-构型等[5]。更大的核酸结构如核小体和染色体包括染色体定位、转录、转移和小分子DNA交互作用等同样可用AFM来研究。Tiner等利用AFM观察到了三链DNA (H-DNA)结构，并得到H-DNA与双链DNA的厚度明显不同,经过仔细测量发现H-DNA的结构与现有理论模型符合得很好[6]。Jiao等动态观察了p53蛋白和DNA的相互作用，实验观察到p53与DNA结合、分开及其在DNA上滑动等现象,甚至发现了p53与DNA特异的序列结合[7]。Sahin等利用AFM进行了G-显带染色体的观察,发现在染色体显带区域染色质浓密凝集,而非显带区染色质则松散,而姐妹染色体常在此区域借助染色体丝来相互联系[8]。

(3)多糖：生物学上多糖的复杂性和重要性不言而喻，虽然多糖分子往往带有支链，分子的均一性及线性不如DNA和蛋白质好，但用AFM可以清楚地观测多糖分子的高级结构与二维网络结构，并可研究多糖浓度及几种离子在不同浓度下对凝胶网络形成的影响。Baldwin等用AFM研究了土豆和小麦淀粉颗粒表面。两类淀粉具有不同的表面形貌，土豆淀粉粒表面有许多突起部分，直径在100～300 nm，在相对平坦的面上包含一些10～50 nm的微结构；而小麦淀粉的突起部分相当少，表面较平滑。Baldwin等认为这些突起部分代表淀粉颗粒表面的支链淀粉侧链簇的末端，与“blocklets”结构相对应[9]。而Leslaw等用非接触式AFM系统地研究了各类淀粉颗粒表面的拓扑形貌，发现玉米淀粉和木薯淀粉的颗粒表面比马铃薯淀粉颗粒表面要平滑，后者的颗粒表面有高达1μm的突起[10]。Andrew利用接触式AFM观察到淀粉颗粒内部的纳米结构, 发现玉米淀粉颗粒内部生长环之间有400～500 nm的阻隔带。且发现在制样过程中由于切割刀的作用将淀粉颗粒生长阻隔带(block)处拔出90 nm深的坑[11]。McIntire等用非接触模式AFM观察了直链淀粉的纳米结构，发现直链淀粉分子在水溶液中分散较好，在75个淀粉分子中，平均等高线长为230.7 nm[12]。

2. AFM在生物力学研究中的应用

生物体内几乎所有的物理化学过程都与生物分子结构中某些特异位置之间的弱键作用相关。根据简单模型得到的生物分子间的作用力需经过理论计算进行推断, 其结果太理想化因而很难真实反映生物分子的实际状况，同时也无法动态反映生物体内的分子运动过程。而利用AFM可实时测量生理状态生物分子间的作用力及细胞表面的动态变化如：细胞间粘着力、化学基团间的作用力、配体受体间的作用、DNA互补链和核苷碱基间的氢键等，进而综合研究生理环境中的各种生物样品的微观性质[13]。

(1)细胞间粘着力：细胞的粘着对于多细胞有机体的解剖完整性方面具有重要意义。Dammer等人利用AFM测定了海藻细胞的粘着力。在生理环境中，粘着细胞间的粘着力可达400pN。一个粘附分子对之间的粘附力可承受1600个细胞的重量。分子间高度的结合力可能正是形成多细胞海藻有机体完整性的基础[14]。Thie等用AFM研究了人子宫内皮细胞系和人滋养型细胞(JAR)之间的黏附作用。他们将JAR功能性地结合在AFM扫描探针的尖端,然后与单层的子宫内皮细胞层作用不同的时间段。这项研究第一次界定了滋养细胞和子宫内皮细胞间的相互作用[15]。Kim等用光镜和原子力显微镜对鼠成骨细胞间的黏附力作用进行了定性与定量研究，这对于研究多细胞生物体中细胞-细胞间的相互作用是一个非常重要的启示[13]。

(2)化学基团间作用：生物大分子是由许多相互关联的功能团组成，这些功能团间的作用力决定生物大分子的整体属性。Frisbie等人利用经亲水分子功能化的AFM探针，测量了单层有机分子的粘着力和摩擦力，再现了特殊功能基团的二维形貌图。实验表明,在简单的疏水分子--疏水分子、疏水分子--亲水分子和亲水分子--亲水分子间的粘合作用可以多次重复测量。功能基团间粘着作用的方向与预期的结果基本一致，即在亲水基团间的相互作用大于疏水基团间的相互作用，从而能够形成氢键；在各种基团的作用力中，相同基团间的相互作用最强，而不同基团间的相互作用最弱；基团间粘附作用大于这些测量中的不确定性，并且可以多次重复测量，因而可以根据测得的粘附力的大小可以判断这些功能基团[16]。

(3)配体-受体作用： Wong将AFM探针用抗生物素蛋白衍生化,将琼脂糖的珠粒用生物素、去硫生物素或亚胺生物素功能基化,测定衍生化探针与功能基化琼脂糖的珠粒之间的作用力。试验证明生物素类似物与抗生物素单分子间的力是由量子化的力单位组成的。并以类似方式测定了抗生物素--生物素同类物间的作用力，结果显示不同的抗生物素--生物素分子间的去结合力不同；相应的热动力学能量研究表明，去结合力与自由能ΔG的变化无关而与焓变ΔH有明确的线性关系，其比例因子由结合势Reff=ΔHFu给出,其中Fu是去结合力[17]。

(4)DNA互补链和核苷碱基间的氢键：Lee等人测定了DNA互补链间的相互作用力，将DNA寡聚核苷酸共价结合在探针和基底的表面，利用AFM测量了DNA互补链之间的作用力；如果有第三个长DNA偶联于互补链之间，则可以观察到链内和链间的作用力。Antoranz等的研究结果表明AFM不仅可以测定特异碱基对之间的相互作用,而且经由原子力显微镜测量的这类相互作用能很好地与Watson- Crick模型相符合[18]。Ratner等人的实验表明核苷碱基对的氢键作用具有量子化特征,并指出该量子化单位值恰好为一个碱基对间的作用力；另外，力测量试验显示：腺嘌呤--胸腺嘧啶作用曲线上有两个最低值，一个是氢键作用，一个是常规作用；无论胸腺嘧啶过量与否,常规作用的曲线相同；但若加入可溶性胸腺嘧啶,氢键峰值则减小7倍；从上述试验事实可知，在溶液中加入过量的胸腺嘧啶可以专门抑制腺嘌呤尖端与胸腺嘧啶表面的相互作用[19]。

3. AFM在生物大分子研究中的应用前景

AFM作为一种显微探测工具，25年来，已被广泛地应用于在生物学各领域，与以往的各种显微工具相对比，AFM以其分辨率高、样品制备简便、制样过程对样品原始形态影响小、能在生理条件下进行动态研究等优点备受青睐。基因诊断和基因治疗已成为提高医疗水平的热点，在此人们便需要对生物分子进行分子和原子水平结构和形态的直接观察和研究，而AFM正好能够满足这种要求。另外，基因组计划大规模测序工作已基本完成，人们将视线聚焦到了后基因组即蛋白质组的研究上。而想要了解蛋白质的功能首先要了解其结构，AFM提供了这样一个平台。在这个平台上我们不仅可以观察蛋白质结构并了解其功能,还可以动态观察蛋白间的相互作用以及蛋白质与DNA、RNA间的相互作用，这样就可以进一步了解蛋白结构域的功能情况，并由此推断拥有此结构域的蛋白的功能。另外，肿瘤的诊断与治疗仍是一大挑战性课题。AFM可通过对肿瘤细胞的形态来判断肿瘤的类型与属性，从而起到肿瘤诊断作用；作为一种力学操纵手段，AFM可对生物标本进行直接切割、钻孔、打磨等操作，从而能够对细胞进行纳米级的人工操作，以达到对病理细胞进行“手术”的目的，这样便有可能对肿瘤进行治疗。尽管AFM研究中还存在针尖污染、针尖对样品的影响等不利因素，但随着纳米管技术的不断发展，探针制造工艺的不断改进及计算机技术的进步[20]，可以预见，AFM必将为大分子生物学的研究带来突破性进展。

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