低分子右旋糖酐与地塞米松预防脂肪栓塞综合征的实验研究

蔡贤华，吴璐锋，刘曦明，徐 峰，黄卫兵，汪国栋，魏世俊

骨折并发脂肪栓塞综合征(fat embolism syndrome，FES)的救治相当困难，目前尚未取得明显突破，预防一直是FES研究的重点，药物逐渐成为预防FES的重要措施之一［1－4］。在早期固定骨折的基础上，单一药物(如地塞米松等)已显示出一定的预防效果［1－5］，但FES仍有一定的发生率，说明FES发病机制的复杂性。而低分子右旋糖酐加地塞米松联合应用临床观察显示其预防FES的疗效较两药单用强［5］，但无相关的动物实验证实。因此，本研究以静脉注射油酸法建立大鼠FES动物模型，观察低分子右旋糖酐、地塞米松及其联用对FES的预防效果，旨在探讨这些药物预防FES的作用及其机制，为临床应用提供理论依据。

材料与方法

1 材料

健康雄性Wistar大鼠(广州军区武汉总医院实验中心提供)，体重300～320g。油酸注射液(国药集团化学试剂有限公司)，低分子右旋糖酐(武汉滨湖双鹤药业)，地塞米松(湖北天药药业股份有限公司)，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNFα)，髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)测试盒(南京建成生物工程研究所)，ELISA试剂盒(武汉博士德生物科技有限公司)。

2 实验方法

大鼠80只，饲养2周后，随机分为4组:低分子右旋糖酐组(A组)、地塞米松组(B组)、地塞米松及低分子右旋糖酐联用组(C组)、空白对照组(D组)，每组20只。

采用10%水合氯醛腹腔注射(0.3ml/100g)麻醉后，经大鼠尾静脉分别注射相应药物:低分子右旋糖酐20ml/kg加油酸0.2ml/kg(A组)、地塞米松35mg/kg加油酸0.2ml/kg(B组)、低分子右旋糖酐20ml/kg加地塞米松25mg/kg加油酸0.2ml/kg(C组)、油酸0.2ml/kg(D组)。于注射后1、2、3、4小时随机取5只大鼠行动脉血氧分压(PaO2)测定，然后放血法处死大鼠，取肺组织进行相关检测。

3 PaO2检查

于注射前及注射后各时间点，经颈动脉抽取血液0.3ml，立即行PaO2测定。

4 MPO、TNF-α测定

于各时间点取肺组织，用等渗盐水为递质制成20%匀浆，随机分为两部分。一部分按MPO测试盒说明操作，在460nm处，10mm光径，测各管吸光度值;另一部分4 000r/min离心10分钟(4℃)，取上清液按TNF-αELISA试剂盒说明操作，在450nm处测定光密度值，通过标准曲线计算TNF-α生成量。

5 组织学检查

于4小时取肺组织分别行光镜和电镜观察。光镜标本用10%甲醛浸泡，逐级脱水，石蜡包埋，HE染色。透射电镜标本则用3%戊二醛前固定24小时以上，1%锇酸后固定，脱水后树脂包埋，横断面超薄切片，铀-铅复染色。

6 统计学分析

结 果

1 一般情况

各组大鼠尾静脉注射油酸及相应药物后，均表现为心跳加快、呼吸急促，以D组最明显，但无死亡。

2 PaO2检查结果

药物注射前大鼠PaO2为(12.67±0.58)kPa，注射后PaO2均为C组＞B组＞A组＞D组(图1)，组间差异具有统计学意义(F=41.076，P＜0.01)。其中，注射1小时时各组均下降:D组最明显(下降近1/2)，A组次之，C组最轻;随后PaO2均呈进行性上升:C组2小时、B组3小时、A组4小时接近或超过注射前水平，但D组PaO2上升缓慢且4小时时仍低于A组1小时水平。

3 TNF-α检查结果

注射后1～4小时均为D组＞A组＞B组＞C组(图2)，4组之间差异均有统计学意义(F=50.074，P＜0.01;F=46.388，P＜0.01;F=67.575，P＜0.01;F=73.879，P＜0.01)。其中，注射后1、2小时，各组TNF-α值先逐渐上升，随后呈下降趋势，4小时时TNF-α含量均低于初始值。

4 MPO检查结果

注射后各用药组肺组织MPO值低于空白对照组:D组＞A组＞B组＞C组(图3)，4组之间的差异具有统计学意义(F=13.257，P＜0.01;F=23.716，P＜0.01;F=6.204，P＜0.01;F=73.285，P＜0.01)。其中，注射1、2、3小时时，各组MPO值基本上呈逐渐上升趋势，4小时时下降。

5 组织学改变

光镜观察各组均有广泛肺泡间质水肿与肺泡腔渗出，以D组最为严重，A、B组有不同程度减轻，C组最轻(图4)。电镜检查见A组、B组肺泡Ⅱ型细胞内线粒体均呈不同程度肿胀，肺泡腔内散见油酸滴，并见白细胞、纤维素渗出;C组Ⅱ型细胞内板层小体良好，肺泡腔内可见单核细胞及红细胞渗出;D组Ⅱ型细胞退变，胞浆内板层小体破裂，肺泡腔内可见较多巨噬细胞及纤维素等渗出(图5)。

图1 各组PaO2水平随时间变化

图2 各组TNF-α`随时间的变化趋势

图3 各组MPO随时间的变化趋势

图4 各组肺组织光镜下改变

图5 各组肺组织电镜下改变

讨 论

1 油酸静脉注射制作FES动物模型的特点

静脉注射油酸、甘油三油酸酯、骨髓脂肪均可制作FES动物模型［1，6］。由于肺血管栓塞或血管内皮细胞损伤，动物注射后出现呼吸急促、心动过速、PaO2下降;病理学检查呈现肺泡内渗出，肺间质充血、水肿或坏死及炎性细胞浸润等化学性肺部炎症改变［6－8］，这些表现与FES相似。骨髓脂肪制作的模型与临床最为接近，但小型动物不易提取。油酸所致模型优点是简单易得，模型稳定且重复性强，成本低;缺点是油酸剂量与注射速度不易掌握，剂量偏小或速度过慢PaO2下降不明显，剂量偏大或速度过快容易死亡，不利于长时间观察。精确控制油酸剂量与注射速度，可显著提高造模的成功率与可行性，此方法已广泛用于FES、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、急性肺损伤等研究［6－8］。故本实验选用油酸静脉注射法制备动物模型。

FES的病变主要在肺，临床表现以低氧血症为主。注射油酸前PaO2为(12.67±0.58)kPa、注射油酸后1小时时PaO2降为(6.43±0.57)kPa，说明PaO2变化明显。笔者结合人类FES诊断标准［2，5，8］，以PaO2≤8kPa为大鼠FES低氧血症的判断标准。当油酸静脉注射剂量为0.2ml/kg时，大鼠PaO2下降能达到此标准。本实验静脉注射油酸后大鼠表现为呼吸、心跳加快、PaO2下降;病理切片示大鼠肺组织表现出广泛出血，肺叶梗死(图4、5)，这表明FES模型制作是成功的。

2 地塞米松与低分子右旋糖酐对FES的预防作用与机制探讨

PaO2是早期诊断FES的可靠且敏感指标之一，也是肺组织损伤时肺部病理改变的直接反应，阻止PaO2降低、减轻肺组织损伤是FES预防中的关键措施［9］。本实验显示，使用药物初期能不同程度地减轻油酸注射所引起的PaO2下降，且随着时间的推移，各用药组PaO2逐渐上升，其作用:C组＞B组＞A组。这表明地塞米松、低分子右旋糖酐均能降低FES低氧血症发生的风险或程度，联合用药作用最强，地塞米松次之。组织学检查结果与之相对应，即各用药组均能明显降低FES引起的肺部病理改变(图4、5):联合用药＞地塞米松＞低分子右旋糖酐。可能的原因是各用药组能不同程度地抑制或降低对肺泡Ⅱ型细胞损害，减轻肺泡壁水肿与肺泡腔渗出。此结果与文献报道类似［1－5］。

TNF-α、MPO主要分别由巨噬细胞及中性粒细胞分泌。TNF-α在油酸所致肺损伤中是一个前炎性递质［9］，能诱导中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞等分泌具有趋化中性粒细胞功能的白细胞介素-8(IL-8)，中性粒细胞被激活后脱颗粒、释放溶酶体，导致MPO峰值出现，产生过多的氧自由基;同时它介导肺毛细血管内皮细胞的损害，增加其通透性，并刺激内皮细胞释放大量组织因子，损害毛细血管的抗凝功能，导致微血栓的形成，从而引起急性肺水肿［3，9－10］。因此，肺组织中TNF-α、MPO的变化能在一定程度上反映FES的严重程度及其发病机制。本实验中各组TNF-α于2小时达到高峰，与文献报道相似［9］。各用药组TNF-α水平较空白对照组低(D组＞A组＞B组＞C组)，随时间延长而作用更明显(图2)。除峰值延缓1小时外，MPO水平的变化与TNF－α相似。这些现象与同时相PaO2和肺组织病理改变呈对应关系，表明各用药组均具有预防FES作用(联合用药＞地塞米松＞低分子右旋糖酐)，其主要机制可能是稳定巨噬细胞和中性粒细胞细胞膜，从而减少其相应细胞因子的生成。此外，地塞米松还能阻止炎症应答反应并抑制血小板聚集［3］，低分子右旋糖酐能减轻肺内红细胞聚集，改善微循环［5，9］。

综上所述，地塞米松、低分子右旋糖酐均具有一定的预防大鼠FES作用，联合用药作用最强，地塞米松次之。其机制较为复杂，联合用药可能是同时阻断了FES发生的多个病理环节，包括稳定巨噬细胞和中性粒细胞等细胞膜、抑制对肺泡Ⅱ型细胞损害并减少肺组织TNF-α与MPO生成或改善肺内微循环等。

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