肺癌细胞裂解物负载对树突状细胞分泌的exosome诱导抗肿瘤作用的影响

张在云，李希德，刘 叶，王志仑，潘祥林

(1山东大学第二医院，济南250033;2高密县中医院)

生物免疫治疗是肿瘤治疗的重要手段，胞外体(exosome)是多种细胞分泌到细胞外的小囊泡，具有抗原呈递和诱导抗肿瘤免疫作用［1］。近年来exosome肿瘤疫苗受到广泛关注，成为目前肿瘤免疫治疗研究的热点。树突状细胞(DC)是目前所知功能最强的抗原呈递细胞，DC来源的exosome含有抗原呈递分子及丰富的共刺激分子，与肿瘤抗原结合能激发抗肿瘤作用［2］。肿瘤细胞裂解物含丰富的细胞成分，用细胞裂解物刺激能否增强exosome诱导的抗肿瘤作用尚不清楚。2009年10月～2010年10月，我们观察了肺癌细胞裂解物负载对DC分泌的exosome抗肿瘤作用的影响，旨在为制备高效的exosome肿瘤疫苗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 1640培养基(Gibco公司);GM-CSF(先灵葆雅公司);IL-4(R＆D 公司);TNF-α(R＆D 公司);CD1a、CD80及 CD83抗体(Immunotech公司);MTT(Sigma公司);超滤离心管(Millipore公司);鼠抗人 HSP70、HLA、CEA 抗体、兔抗鼠 IgG、ECL(Santa Cruz公司);A549肺癌细胞株为本实验室保存。流式细胞仪(Beckman-coulter公司);超声波细胞粉碎仪(宁波新科公司);超速冷冻离心机(日立公司);透射电镜(Philips公司);酶标仪(Bio-Rad公司)。

1.2 肺癌细胞裂解物负载DC的制备及鉴定 分离外周血单个核细胞，贴壁培养2 h，用尼龙毛自非贴壁细胞分离T细胞，备用。贴壁细胞用含GMCSF(1 000 U/ml)及IL-4(500 U/ml)的培养基培养，第5天起加用TNF-α100 U/ml。倒置显微镜下见细胞表面出现突起及毛刺，表现为典型DC形态。第10天收集DC，调整细胞数为每管1×106个，加入CD1a、CD80及CD83抗体，流式细胞仪检测细胞表面标志分子 CD1a、CD80及 CD83表达均升高，证实为典型DC。将A549细胞用RPMI1640培养基培养，0.25%胰酶消化收集，调整细胞浓度为5×106/ml，置液氮10 min，37℃水浴溶解，反复冻融3次，用超声波细胞粉碎仪裂解细胞(160 W，持续3 s，间隔5 s，共3 次)，10 000 ×g离心 10 min，取上清，用 0.22 μm微孔滤膜过滤，-20℃保存备用。收集培养第5天DC，将细胞裂解物加入DC，并加TNF-α100 U/ml，培养72 h即得肺癌细胞裂解物负载DC。

1.3 肺癌细胞裂解物负载DC的exosome提取及鉴定 取肺癌细胞裂解物负载DC的上清液，用差速离心法提取exosome。细胞培养上清液1 000×g离心10 min;取上清，10 000×g离心10 min;取上清液，将30%蔗糖/重水垫、上清液及PBS依次放入离心管中，100 000×g离心1 h;取混有exosome的蔗糖/重水垫，用PBS悬浮，加入到100 kD超滤离心管过滤，用0.22μm的滤膜过滤除菌。透射电镜下观察exosome形态，呈圆球形，囊泡状，大小不一，直径在30～100 nm，即为典型 exosome形态［3］。将 exosome冲击破膜，取20μg用SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白电转移至硝酸纤维素膜，室温封闭1 h，加入鼠抗人HSP70、HLA及CEA抗体，再加入兔抗鼠IgG抗体，ECL反应显影结果示HSP70、HLA及CEA均呈阳性表达。

1.4 T细胞活化及杀伤率测定 将肺癌细胞裂解物负载DC的exosome(负载组)及未负载DC的exosome(未负载组)各10μg分别加入T细胞混合培养72 h，制成exosome刺激活化的T细胞。将肺癌细胞裂解物负载DC(DC组)与T细胞按1∶10混合培养72 h，制成DC活化的T细胞。以活化T细胞为效应细胞(E)，A549肺癌细胞为靶细胞(T)，按E/T为25∶1、10∶1、5∶1 比例混合培养 96 h，加入 MTT(5 mg/ml)20μl，继续培养4 h，用酶标仪测波长490 nm的吸光度(A)值。重复实验3次。计算杀伤率。杀伤率(%)=［靶细胞A值-(反应孔A值-T细胞A值)］/靶细胞A值×100%。

1.5 统计学方法 采用SPSS12.0统计软件，计数资料比较行χ2检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 exosome相关蛋白表达 蛋白检测显示肺癌细胞裂解物负载 DC来源的exosome有HSP70、HLA及CEA表达，而来源于未负载DC的exosome有HSP70及HLA表达，但无CEA表达。

2.2 杀伤率 E/T 为25∶1、10∶1、5∶1 时各组杀伤率均呈降低趋势，负载组杀伤率分别为65.11% ±6.84%、43.21% ±4.89%、23.19 ±3.25%，未负载组分别为 30.50% ±4.11%、20.33% ±4.16%、10.34%±3.07%，DC 组分别为 50.25% ±4.43%、30.31% ±4.57%、17.34% ±3.20%，相同 E/T 值时负载组杀伤率均明显高于未负载组(P均＜0.05);E/T为25∶1、10∶1时负载组杀伤率明显高于DC组，P均＜0.05。

3 讨论

exosome最早由Trams于正常细胞和肿瘤细胞培养上清液中发现，后来在研究网织红细胞成熟为红细胞阶段发现其释放同样的小囊泡状结构，并命名为exosome。研究显示，exosome可由B淋巴细胞、DC、肥大细胞、肠上皮细胞、肿瘤细胞及血小板等分泌［4，5］，组成复杂，含有与来源细胞功能相关的蛋白质或脂质等成分，由于不同细胞来源的exosome成分不同，因而其功能各异。exosome作为一种新的非细胞性肿瘤疫苗，避免了传统细胞性瘤苗的不足，可高效呈递抗原。其组成明确，稳定性高，能够在-80℃中保存至少2 a，应用于人体不良反应小。

DC为功能强大的专职性抗原呈递细胞，是机体抗肿瘤免疫反应的启动者和参与者，将DC的抗原呈递功能与肿瘤抗原结合是活化T细胞的关键。用肿瘤特异性抗原、肿瘤非特异性抗原、肿瘤抗原肽、肿瘤细胞RNA及肿瘤细胞裂解物冲击DC活化T细胞显示了不同程度的抗肿瘤作用，其中肿瘤细胞裂解物负载诱导的抗肿瘤效力更强［6，7］。DC分泌的exosome含有丰富的抗原呈递分子(MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ)、热休克蛋白(HSP70、HSP90)、四穿膜蛋白(CD9、CD63、CD81)、黏附分子(CD11b、CD54)和共刺激分子CD86等免疫分子，可通过暴露MHC分子及共刺激分子直接调节免疫反应，亦可通过转运内体成分到邻近细胞而间接调节免疫反应［8］。但由于DC来源的exosome缺乏肿瘤抗原，因而不能有效活化T细胞。经肿瘤抗原负载DC分泌的exosome含肿瘤抗原和抗原呈递所需物质，可以呈递抗原，直接刺激活化T细胞，诱导抗肿瘤免疫，其作用机制为:DC质膜表面的MHC分子结合抗原后通过内吞形成多囊体，然后向胞外释放exosome，这些exosome携带了结合抗原的MHC复合物，能被效应细胞捕获或定向于效应细胞，然后与效应细胞的质膜融合而将抗原提呈给效应细胞，同时exosome上存在的共刺激分子(CD80、CD86)将淋巴细胞活化，发挥特异性抗肿瘤作用［9］。

本研究用肿瘤细胞裂解物负载DC提取exosome显示有CEA表达，表明exosome含有肿瘤抗原。用exosome刺激活化的T细胞对A549肺癌细胞有明显杀伤作用，负载组杀伤率明显高于DC组和未负载组，表明经肺癌细胞裂解物负载DC的exosome能有效诱导抗肿瘤作用。用肿瘤细胞裂解物负载DC制备exosome疫苗，方法简单方便，效力强，具有良好的应用前景。

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