宫颈上皮内瘤变组织中HPV检测及分型结果分析

邓 婕,许巧巧,丁细桃,庞玲霞

(1温州医学院,浙江温州 325035;2温州医学院附属第一医院)

HPV检测倍受人们重视,但大多为原位杂交或PCR法对新鲜组织或脱落细胞中特定HPV亚型的检测,而应用基因芯片技术对石蜡包埋组织中的HPV分型检测鲜见报道。2008年 8月 ～2010年 9月,我们采用基因芯片技术对 78例经病理证实的宫颈上皮内瘤变(CIN)组织进行HPV分型检测,并探讨其临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料 本研究78例宫颈CIN(Ⅰ级28例、Ⅱ级25例、Ⅲ级25例)组织均来温州医学院第一附属医院病理科 200～2009年经病理证实的存档病例,均行HE染色复查筛选。患者均为温州市人,年龄22～72岁,取材前均未行放疗和化疗。

1.2 HPV检测及分型方法 将标本4μm切片5片,置EP管底,加入裂解液100μl;100℃水浴10 min后立即13 000 r/min离心10 min,取中层DNA溶液5μl加入含有通用引物的20μl PCR反应体系进行扩增。PCR扩增条件:50℃15 min,95℃10 min,94℃30 s,42℃90 s,72℃30 s,40个循环后72℃延伸5min。将固定了 23种探针的膜条标记后与PCR产物一起放入6 ml杂交液A(2×SSC, 0.1%SDS)中,100℃变性10min后置于51℃杂交箱进行杂交至少1.5 h,杂交后将膜条置 51℃预温的洗涤液B(0.5×SSC,0.1%SDS)漂洗5 min,再用POD酶溶液(1︰2 000)于室温轻振摇30min,A液摇洗2×5 min,C溶液(0.1 M柠檬酸钠)洗涤1～2 min,放入新配的显色液中显色10～30 min后肉眼判读结果。阳性对照为HPV35阳性病例,空白对照以蒸馏水取代DNA提取液,检测的HPV亚型包括18种高危型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4)和 5种低危型(HPV6、11、42、43、44),受检样本的阳性在对应的HPV亚型探针位点出现蓝色圆点。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。率的比较采用 χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CIN中HPV感染率 本组患者中HPV阳性53例(67.9%),其中CINⅠ～Ⅲ中分别为13例(46.4%)、16例(64.0%)、24例(96.0%)。HPV阳性率随着CIN级别升高而增加,CINⅠ与CINⅡ比较,P＞0.05;CINⅢ与CINⅠ、CINⅡ比较,P均＜0.05。

2.2 CIN中HPV高、低危亚型的分布 本组除CINⅠ中存在2例单纯HPV低危亚型感染,CINⅡ和CINⅢ中各有1例HPV高、低危亚型复合感染外,其余均为HPV高危亚型单一或者多重感染。

2.3 CIN中HPV亚型频度分布 本组共检出了13种HPV亚型(HPV 6、11、16、18、31、33、45、51、52、56、58、59、66)。在各级别CIN中,HPV 16、58感染率最高,其中HPV16在CINⅠ～Ⅲ级中的感染率依次为14.3%(4/28)、20%(5/25)、52.0%(13/ 25),HPV58分别为10.7%(3/28)、12.0%(3/25)、 28%(7/25)。CINⅠ中感染的HPV亚型依次为HPV16(4/28)、HPV58(3/28)、HPV52(2/28)、HPV66(1/28)、HPV6(1/28)、HPV11(1/25),CINⅡ中为HPV16(5/25)、HPV58(3/25)、HPV18(3/ 25)、HPV52(2/25)、HPV 33(1/25)、HPV51(1/ 25),CINⅢ中为HPV16(13/25)、HPV 58(7/25)、HPV33(4/25)、HPV18(2/25)、HPV31(2/25)、HPV52(1/25)。

2.4 CIN中HPV单一感染和多重感染 在HPV阳性的53例中,单一感染44例(83.0%),双重感染8例(15.1%),三重感染(HPV 16,33,59)1例(1.9%)。其中在 CINⅠ中单一感染 12例(92.3%),未见双重感染,三重感染1例(7.7%); CINⅡ中单一感染15例(93.8%),双重感染1例(6.2%),未见三重或以上多重感染;CINⅢ中单一感染17例(70.8%),双重感染7例(29.2%),未见三重或以上多重感染。所检出的13种 HPV亚型中,除HPV31只见双重感染外,其他亚型均存在单一感染。

3 讨论

目前,宫颈癌一般认为是从CIN逐步发展而来的,在这个过程中,高危型HPV持续感染是导致宫颈癌发生的必要条件。本研究显示,CIN患者存在极高的HPV感染率,且随病变级别上升HPV感染率呈明显升高趋势,与 Liu等[1]的研究结果相似。这表明HPV感染是宫颈CIN逐步发展的必要因素,在低度病变(CINⅠ)中,部分患者存在HPV感染,当机体免疫清除不利时,HPV病毒得以持续感染,从而与宿主肿瘤细胞相整合,分别与细胞内肿瘤抑制物p53、pRb结合使肿瘤抑制物失活。这样宿主细胞中原癌基因与肿瘤抑制基因发生突变的可能性大大增加,从而导致细胞异常增殖[2～4]。在 CINⅢ中HPV感染率明显高于CINⅠ、CINⅡ,这也证实了HPV持续感染是CIN逐步向前发展的危险因素之一。

本研究结果发现,在CIN中几乎是高危型HPV单一感染或多重感染,仅CINⅠ中有2例为单纯低危型HPV感染,这表明高度病变(CINⅡ、CINⅢ)主要是由高危型HPV持续感染所致。但在宫颈CINⅠ中也出现了高危型 HPV感染为主,与现有报道[5,6]不完全一致。其原因可能有以下两点:①我们所选的该组病例数过少,不一定能作为整体的代表;②提示CINⅠ感染HPV高危亚型者具有更进一步往高级别CIN,甚至宫颈浸润癌发展的可能,其预后可能较差。因此,应该对该部分患者应进行密切随访和定期复查。

目前,学者们对HPV单一感染和多重感染与宫颈疾病之间的关系持不同观点。陶萍萍等[7,8]认为,HPV多重感染与宫颈病变呈正相关。本研究结果显示,在各级别 CIN中均多以单一感染占优势,多重感染在CINⅠ和CINⅡ中的比率未见明显差异,而在CINⅢ多重感染的比率明显高于CINⅠ和CINⅡ。多重感染提示机体免疫机制清除病毒不利,是病毒持续感染的危险因素,从而导致病情的进展,最终发展为高级别 CIN甚至宫颈癌[9～11]。

综上所述,应用基因芯片技术对HPV进行分型检测,根据感染的亚型预测CIN发展的可能,有利于为 CIN患者制定合理的治疗方案,有利于评估CIN的手术效果和药物疗效,还能够针对性的指导HPV预防疫苗和诊断疫苗的开发,最终有效降低宫颈癌的发生率和病死率。

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