肾透明细胞癌肿瘤相关基因的表达

肖耀军,陈壮飞,郑少斌

(南方医科大学附属南方医院,广州 510515)

肾透明细胞癌(ccRCC)是泌尿外科较常见的一种恶性肿瘤。我们采用 60～70mer的长链寡核苷酸基因芯片,检测ccRCC组织和癌旁正常肾组织的基因表达谱,分析其基因差异表达情况,探讨肾透明细胞癌的肿瘤相关基因。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2006年2月～2007年3月本院收治的ccRCC患者4例。3例肾癌标本于肾癌根治术后0.5 h内置于液氮罐冻存备用,1例正常肾组织标本取自T1期肾癌距原发灶5 cm以上的正常区域肾组织。所有标本均经常规病理检查证实。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取、荧光标记及cDNA的合成分别取上述各组织样品50～100mg,用Trizol提取法提取总RNA,测定浓度并进行质量鉴定。用Low Input RNA Fluorescent Linear Amp lification Kit试剂盒将提取合格的RNA进行双色荧光标记。4个标本各取总RNA 2μg,按照常规逆转录方法合成cDNA。

1.2.2 荧光标记cRNA的合成与纯化 用Cy3标记肿瘤组织,Cy5标记正常肾组织,进行cRNA的合成。将cRNA样品转移到RNeasy微型纯化柱, 13 000 r/min离心30 s,弃滤液;向柱子中加500μl的RPE缓冲液,13 000 r/min离心60 s,弃滤液。将纯化柱转移到新的收集管,在纯化柱滤膜中央加入30μl的无RNA酶水,室温放置60 s,13 000 r/min离心30 s,收集到约60μl的cRNA纯化液,测定样品浓度后,-80℃遮光贮存,备芯片杂交用。

1.2.3 芯片杂交、洗片和扫描 取以Cy3及Cy5标记的线性扩增cRNA各0.75μg混合,50μl的10×对照质控样品,用去核酸酶水调至 215μl,混匀, -80℃避光保存。2×cRNA中加入9.0μl的25×片段化缓冲液,轻轻混匀,60℃避光孵育30m in后,加入 225μl的 2×杂交缓冲溶液,轻轻混匀,离心沉淀。取一新盖玻片,标签面向上置于杂交盒底座,在盖玻片上滴加400μl杂交标本,将Agilent Human 1B寡核甘酸芯片数字面向上盖在盖玻片上。组装好杂交盒,于杂交炉中60℃、4 r/min杂交16 h。取出芯片,置于洗液 1中,将芯片与盖玻片分开,漂洗后取出,置入新的洗液1中室温漂洗10 min,洗液2漂洗 5 min,氮气吹干,遮光保存。将芯片置于Agilent2565BA基因芯片扫描仪中扫描,参数设置采用扫描仪的默认参数,扫描后的数据用Feature extraction软件进行分析及均一化处理。

1.2.4 共同差异表达基因的判断 以Cy3(gprocessedsignal)以及Cy5(rprocessedsignal)LogRatio P Value为标准进行判断,若P＜0.01则认为该基因在疾病初诊或复发时的表达存在差异,gprocessedsignal＜rprocessedsignal则界定为基因表达上调, gprocessedsignal＞rprocessedsignal则界定为基因表达下调。3例ccRCC患者中每1例复发时均表达上调的基因为共同上调基因,均表达下调的基因为共同下调基因,共同差异表达基因包括共同上调基因和共同下调基因。

2 结果

2.1 RNA质检结果 3例癌组织和1例正常肾组织总RNA的A260/A 280为1.7～1.9,总RNA的电泳带18 s和28 s均清晰,表明核酸成分完整,无降解,无蛋白质和有机溶剂等污染。经Agilent2100生物分析仪测定,曲线标准,符合实验要求。

2.2 芯片杂交质控结果 2张芯片杂交结果经Feature extraction软件严格筛选,芯片中全部22 000个点中有效杂交达99%以上。

2.3 正常肾组织和肾癌组织的基因表达谱差异比较 将3例癌组织的基因表达谱分别与正常肾组织的基因表达谱进行对比。结果显示,1例上调基因 403个、下调基因 399个,1例上调基因 1 783个、下调基因 2 415个,1例上调基因 2 756个、下调基因 3 307个;3例癌组织与正常组织比较,共筛选出差异表达基因 204个,其中共同上调基因 31个(占15.2%)、共同下调基因173个(占84.8%),其中包括6个尚未被Genebank收录的人类新基因。

3 讨论

肿瘤的发生发展通常需要多个癌基因的激活,以及抑癌基因和细胞增殖、分化、凋亡等相关基因的协同作用。我们采用长链寡核苷酸基因芯片检测ccRCC组织的基因表达谱,共发现差异表达基因204个,上调的基因 31个,下调的基因 173个。从基因的功能分类看,这些差异表达的基因主要包括癌基因、抑癌基因和细胞信号传导、细胞周期、DNA转录翻译、凋亡、细胞因子、代谢酶类等编码基因。

本研究发现的 204个差异表达基因,除去 6个新基因及 11个编码但功能不明确的基因,其余均可根据Genebank精确定位,确定其所在的染色体区带及功能。从本实验差异表达的基因的染色体定位情况分析,上调基因主要分布在 2p、3p、5q、9p、10q、11p、14q、20q等,而下调的基因主要分布在 1q、1p、3q、3p、4p、7p、11p、12q、13q、14q、17p和19p等,与以往的研究结果比较接近[1]。说明 ccRCC的发生与染色体的异常相关,差异表达基因较集中地分布在染色体的一定区带上。统计发现,位于 3p、14q、5q的分别有13、9、6个差异表达基因,分别占 7.0% (13/187)、4.8%(9/187)、3.2%(6/187),属于比较集中的几个区域,3p区的 13个差异表达基因中有大家熟悉的VHL基因。VHL基因定位于染色体3p25～p26,其编码的蛋白产物为pVHL,pVHL与细胞周期调控、细胞间信号传导、细胞外纤维连接、蛋白形成及血管形成等肿瘤发生发展相关的生物学过程密切相关[2]。研究[1,3]表明,ccRCC患者 3p杂合性缺失、VHL基因突变以及甲基化所致VHL基因失活是原发性散发ccRCC发生的主要分子机制之一,而ccRCC患者中VHL基因突变率高达57%。据此,有学者提出,根据ccRCC基因表达谱的表达情况,将ccRCC进一步分成VHL突变阳性型和阴性型两类。

本实验结果显示,包括原癌基因EGFR和抑癌基因VHL在内的诸多重要基因均呈显著差异表达,其中EGFR和VHL的平均Ra值分别为15.01和0.04,即分别上调 15倍和下调 25倍,HIF-1α平均Ra值为28.00,上调28倍。VHL、HIF-1α和EGFR等这些基因的明显差异表达,揭示其与ccRCC的发生密切相关,这一点已普遍地被人们接受[3]。

目前大多数研究者[4]认为,ccRCC的发生与染色体的异常相关。如 1、3、5、6、9、13、14号染色体的部分缺失或扩增,其中单一染色体异常较多见的是3号染色体。据统计,3号染色体或 3p的缺失异常约占 60%,此外还包括 14q的缺失和 5q的放大。Chen等[5]用SNP芯片检测80例ccRCC组织,发现最易出现杂合性丢失的是 3p,共有 69例(占86.25%),其次是 8p12、6q23.3-27、14q24、9q32、10q22等;出现 5q异常扩增的有 32例。Arai等[6]通过对51例ccRCC组织基因聚类分析,也发现3p的缺失和 5q的扩增是最常见的染色体异常。

[1]Beroukhim R,Brunet JP,Di Napoli A,et al.Patterns of gene expression and copy-number alterations in von-hippel lindau diseaseassociated and sporadic clear cell carcinoma of the kidney[J]. Cancer Res,2009,69(11)：4674-4681.

[2]Pause A,Peterson B,Schaffar G,et al.Studying interactions of four proteins in the yeast two-hybrid system：structural resemblance ofthe pVHL/elongin BC/hCUL-2 complex with the ubiquitin ligasecomplex SKP1/cullin/F2 box protein[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(9)：9533-9538.

[3]果宏峰,龚侃,邹霜梅,等.肾透明细胞癌中VHL基因突变与缺氧诱导因子-1α表达的研究[J].中华泌尿外科杂志,2004,42 (11)：196-200.

[4]Monzon FA,Alvarez K,Gatalica Z,et al.Detection of chromosomal aberrations in renal tumors：a comparative study of conventional cytogenetics and virtual karyotyping with single-nucleotide polymorphism microarrays[J].Arch Pathol Lab Med,2009,133(12)：1917-1922.

[5]Chen M,Ye Y,Yang H,et al.Genome-wide profiling of chromosomal alterations in renal cell carcinoma using high-density single nucleotide polymorphism arrays[J].Int JCancer,2009,125(10)：2342-2348.

[6]Arai E,Ushijima S,Tsuda H,et al.Genetic clustering of clear cell renal cell carcinoma based on array-comparative genomic hybridization：itsassociation with DNAmethylation alteration and patient outcome[J].Clin Cancer Res,2008,14(17)：5531-5539.