石斛繁殖技术研究进展

朱涵毅，王慧中，薛大伟

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036)

石斛繁殖技术研究进展

朱涵毅，王慧中，薛大伟*

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036)

石斛是重要的观赏和药用植物，当前石斛繁殖不能满足市场需要.文章对目前石斛繁殖研究中存在的问题进行了分析，对现用的石斛繁殖方式进行了比较和总结，以求为石斛繁殖提供方法和依据，并为后续研究提供思路，从而有效提高石斛繁殖的效率，达到保护濒危物种和满足市场需求的目的.

石斛；繁殖技术；组织培养

石斛兰是兰科植物中的第二大家族，有1 500～1 600个原生种，是我国古文献中最早记载的兰科植物之一，其花姿优美，花色艳丽，花期较长，多具芳香性，深受人们喜爱，在国际花卉市场占有重要的地位[1].石斛兰不仅是重要的观赏类花卉植物还具有重要的药用价值.在《本草纲目》和《神农本草经》中石斛都被列为上品，我国76种石斛属植物中有40种做药用，著名的有金钗石斛、铁皮石斛、霍山石斛等.但是石斛繁殖能力弱，其果实种子量大[2]，且种子无胚乳，在野生条件下常常需要兰菌[3]的帮助才能萌发，加之市场需求的不断扩大，野生资源的过度采伐，石斛已被列为濒危物种.而且石斛分株能力弱，繁殖系数低，繁殖速度慢，远远不能满足商品化生产的要求[4].因此寻找石斛的快速繁殖方法成为保护石斛物种和满足市场需求的迫切要求.文章对近年来石斛快速繁殖和石斛组织培养的新进展做了综述以期为后续研究提供建议.

1 石斛组织培养研究

1.1 石斛组织培养的优势

植物组织培养由于可以较好地保证原品种的纯度，繁殖系数高，培养周期短，且繁殖培养不受季节和生长限制，在大规模生产中已得到广泛使用.1922年，美国学者Kundson首次证明兰花种子可以在无机盐、糖、琼脂组成的人工合成培养基上无需共生菌帮助萌发[5].由于Kundson的发现，使得石斛的组织培养进入了新阶段，在石斛快速繁殖中开始了大规模的应用.

1.2 石斛组织培养的研究内容

目前对于石斛组织培养的研究包括外植体的筛选、培养基组成成分、培养条件等几个方面.由于培养基组成成分可变量多，对石斛繁殖的影响大，因此培养基组成成分的研究一直是石斛组织培养的主要内容.

1.2.1 外植体筛选

外植体筛选的一般原则：一般来说外，植体年龄越小，分化程度越小，组织培养的成功率越高，因此一般选择幼嫩的组织或器官作为外植体；除了外植体的年龄，还要考虑外植体所在部位，一般选取组织分裂能力强，容易形成愈伤组织的部分，如根尖、茎尖、芽及幼嫩的茎；此外，外植体的大小也是要考虑的因素，外植体过大，消毒困难，太小又容易死亡.在石斛组织培养中，虽然外植体的选择研究较多，但方向比较单一，主要是在种子、茎尖、茎段中做选择.也有少量研究中，通过幼芽或根尖作为外植体进行诱导.

种子作为外植体的优势在于种子本身具有分化成完整植株的能力，萌发后成活率高.但是自然条件下，石斛种子自身很难萌发，需要在一些真菌帮助下才能萌发，因此石斛种子的萌发困难；而且大量种子同时萌发使得营养竞争激烈，并不利于大量繁殖，这就需要在种子萌发后对石斛进行分株.黄勇[6]通过高锰酸钾消毒的种子进行人工培养，繁殖出了大量流苏石斛，成活率在90%以上，克服了石斛种子萌发困难的问题.

此外，茎尖也可以作为外植体进行诱导，茎尖跟种子一样同样具有较好的分化能力，在分化过程中形成愈伤组织和原球茎[7]，但是茎尖一般取材较小，成活率低[8].

石斛茎段虽然相对分化程度较高，但幼嫩的茎段还是可以作为外植体使用的，莫昭展等[9]就利用茎段进行流苏石斛茎段腋芽的诱导，通过不同激素配比也得到了大量石斛新植株.

另外，也有研究表明直接利用石斛原球茎切块可以获得大量新植株，蒋波等[10]就利用原球茎切块进行组织培养获得了铁皮石斛新植株.但是目前石斛原球茎的诱导方法还不成熟，直接利用原球茎切块还有一定困难.

1.2.2 培养基组成

1.2.2.1 培养基种类

由于石斛培养周期长，各生长阶段对营养的要求不同，为满足石斛不同生长阶段对营养的不同需求，针对石斛不同阶段的培养基组成都有一定程度的研究.因此石斛培养基也按照生长阶段分成生根培养基、原球茎诱导培养基、原球茎增殖分化培养基、芽分化培养基.

1.2.2.2 培养基组成

石斛组织培养至今在培养基的组成上基本形成了一定的模式，都包含5个部分：基础培养基、碳源、活性炭、天然提取物和激素.但是对于这5个不同组分所选用的具体成分和用量还没有统一的观点.

1) 基础培养基.主要包含大量元素、微量元素和铁盐等植物组织培养必需的成分.目前使用最广泛的是MS，MS应用面广，兼容性好，大部分植物组织培养都可以采用这种培养基.1/2MS是MS的一个改进，其中大量元素的浓度是MS中的一半，其他组分量不变.另外在石斛组织培养中还会使用B5、N6、VW、花宝一号等培养基，这些都是市场上使用比较成熟的培养基，与大规模生产结合更紧密.Suman K等[11]通过KL、VW、MS、W、Nitch、Mitra等几种培养基进行D.fimbriatum种子的离体培养.发现MS、Nitch、VW较利于原球茎的发生，一般为4～5 d；而且Nitch、VW比较适合种子的萌发.曾宋君等[12]以5种石斛为实验对象，在MS、KS、SH、VW、KC、改进N6及PT培养基进行离体培养得出了石斛最适培养基为N6.而后张超等[13]通过1/2MS、MS、VW、KC、花宝一号的对比实验中发现，只有1/2MS和MS能利用文心兰茎尖成功诱导出原球茎，而其他三者却几乎不诱导.

2) 碳源.对于碳源的研究不是很多，主要配合基础培养基进行了一些相关的研究，普遍使用蔗糖作为碳源，但是也有用白糖和片糖作为碳源的报道.如陈春满等[14]在对不同蝴蝶兰品种进行叶片诱导原球茎的研究中就是以白砂糖为碳源.对于碳源的用量一般在1%～3%，另外有报道[15]称蔗糖的浓度会影响原球茎的分化和增殖，在蔗糖用量超过3%时，原球茎的分化停止，增殖也随着蔗糖用量的升高而下降.

3) 活性炭.由于在组织培养过程中石斛容易出现褐化现象，一般都在培养基中加入一定量的活性炭.活性炭可以吸附非极性大分子和色素大分子，减少有害物质的积累，一般加入0.5～10 g/L[16]，但是活性炭的吸附能力选择性差，且会随着温度的改变而发生变化，甚至会发生解吸附[17].所以对于活性炭的用量也没有一个小范围的建议量，大部分研究也只是按经验或习惯加入了一定量的活性炭，通过对比确定活性炭最适浓度的实验暂时未见报道.

4) 天然提取物.天然提取物是除了基础培养基中已经加入的有机质外额外添加的一些有机物，在石斛繁殖研究中常用香蕉、马铃薯、椰乳和芋艿作为天然提取物来源.研究[18]表明:香蕉马铃薯提取物都能促进石斛原球茎的分化，且香蕉提取物效果优于马铃薯；椰乳对原球茎分化的促进作用不明显，但是对原球茎的增殖有较好的促进作用.且椰乳促进原球茎增殖过程中产生的原球茎能保持较好的外观和形态.

5) 激素.培养基的激素组成是目前石斛繁殖培养中研究最多的部分，主要针对激素的种类、激素用量及激素配比进行研究.

在石斛繁殖培养基中常用的激素有IBA、NAA、6-BA、2,4-D、AD等，其中研究最多的是NAA和6-BA.NAA是使用最广泛的生长素，在农业生产中起到巨大作用，在研究领域也是生长素中的首选.部分研究表明NAA可以强化石斛植株，使新苗粗壮有力，但是对增殖却没有好处.蒋波等通过6-BA与NAA正交实验发现，单独加入2 mg/L的6-BA原球茎增殖最快，在此基础上他们得出了石斛原球茎增殖最适培养基组成：MS+6-BA2 mg/L+NAA0.5 mg/L，实验表明在此培养基上进行原球茎增殖实验，50 d后增殖倍数可以达到6倍以上.周俊辉等人的实验[19]表明：低浓度的6-BA对不定芽的增殖最好，随着6-BA浓度的提高，不定芽增殖率和苗的健壮度随之明显下降；1 mg/L的NAA最适合原球茎的增殖.他们认为在生产中，使用B5+6-BA0.1 mg/L+NAA0.5 mg/L+椰乳150.0 mg/L较适合石斛原球茎的诱导增殖，在石斛原球茎的增殖中提高NAA的质量浓度为1 mg/L.但王春等[20]的实验表明6-BA质量浓度以20 mg/L的增殖效果好于0.5 mg/L；黄萍萍等[21]使用的6-BA质量浓度高达4 mg/L.

白美发等[22]实验表明：在石斛幼苗增殖中N6效果最好，B5次之，MS和1/2MS最差；椰乳作为天然添加物效果最好，香蕉和马铃薯效果相似.激素浓度对叶片原球茎形成的影响较大，BA质量浓度高达20 mg/L对叶片原球茎的形成有显著的影响.这与前人的研究有所不同，刘林等[23]通过实验证明BA用量低于10 mg/L时，外植体不能被诱导蝴蝶兰形成PLB.对于白花红唇和黄花红唇品系，秦凡[24]则认为BA5～10 mg/L较为合适，诱导率可达35%～37%，BA浓度过高所产生的原球茎反而下降.崔广荣等[25]认为BA4.0 mg/L+Ad2.0～4.0 mg/L+NAA1-2的激素组合较利于条纹花系品种的叶片原球茎诱导,诱导率可达65%，这可能与品种的差异有关，但在对各品种的研究中均有类似情况，说明该现象具有一定的普遍意义，值得进一步研究.

1.2.3 培养条件

此外，在石斛组织培养繁殖研究中还包括培养方式和光照时间和光照周期等.培养方式主要是液体培养基和固体培养基2种，目前在石斛培养中以固体培养为主，液体培养的研究不多，如莫昭展等也通过液体培养的方式进行原球茎的诱导培养.在光照和光照周期上现在基本形成统一，一般都采用24 h为周期，每天光照12 h.但也有少量研究中采用光照8 h进行培养.

2 石斛的其他繁殖手段

2.1 分株繁殖

石斛通常成丛生长，有数个或多个肉质的长茎，茎上有节.最简单的分株繁殖方法就是从丛生茎的基部切开或掰开，一分为二，分别种于不同的盆中，即可达到分株的目的.有些石斛种类在茎的顶端或基部生有小植株.小植株根、茎、叶俱全，待长到一定程度时，可切下栽于盆中；也有的种类可以扦插繁殖，亦即将肉质茎切成许多小段，每段带2～3节，插在用泥炭、水苔、腐殖质组成的基质中，置于湿润、温暖、荫蔽的环境中，经过几个星期后可以看到长出l～2个小根，此时可移栽于小盆中，将这些新芽进行分株既可以缓解生长带来的竞争，又可以获得新的植株.新芽分株一般在每年3月份，在新芽尚未萌发之前进行.方法操作简单，植株长势优良.但是每年只能进行一次分株，且每次分株获得的新植株数量有限，与庞大的市场需求相比显得杯水车薪[26].

2.2 扦插繁殖

扦插繁殖可以在盛夏和严冬以外的季节进行，相对分株法限制相对较少，只要不在开花期就可以挑选充实的石斛兰假鳞茎进行扦插繁殖.选取未开花的石斛兰假鳞茎，用消毒过的刀具从根际剪下后，按2～3节的长度剪切成小段，切口可涂适量草木灰，竖直扦插在用水苔和蛇木屑(水苔：蛇木屑=7：3)混合制成的扦插床上进行，待生根发芽后便可移栽入盆.栽种时将新芽连带老茎一起栽种在盆中央，深度以水草刚好盖过根系为度.这种方法在一定程度上增加了繁殖数量，但还是不能满足市场需求[27].

2.3 高芽繁殖

高芽繁殖是石斛兰的一种特殊的繁殖方式.部分假鳞茎在成熟后会在顶端处的芽眼处长出高芽，高芽其实就是一种具有根茎叶的小植株.高芽繁殖的操作也比较简单方便，待小植株长至高8～10 cm，根数3～4条时，用消毒过的刀剪，将小植株切下，用70%的代森锰锌等可湿性粉剂杀菌处理伤口，再将芽放在盆中央，根向四周展开，慢慢填入植料即可.由于从假鳞茎上获得高芽的量远大于分株方式，因此，高芽方式可以在一定程度上获得更多的新植株[28].

2.4 试管苗繁殖

试管苗繁殖是近年来投入规模生产的有效方式，现在石斛中最常用的组织培养也属于试管苗繁殖的一种，除了组织培养还有无菌播种等[29].

无菌播种繁殖可以在短期内获得大量的种苗，为新品种的选育提供了基础，缺点是种苗性状差异大.而组织培养，利用外植体诱导产生愈伤组织或原球茎进而分化成完整新植株.通过组织培养可以获得与母体相同性状的大量高整齐度的新植株，是现阶段经济有效的快速繁殖法，也是工厂化育苗的重要途径[30].

3 问题与展望

3.1 研究内容多而杂.在培养基研究中同样是对激素的研究，但不同文献研究材料有的用的是种子，有的用的是茎段；研究对象有的是针对原球茎的增殖，有的是针对不定芽增殖.同样的研究内容没有形成系统性和一致性.后期石斛繁殖研究应该在单一问题中采用相同材料及相同对象进行研究，以优化实验结果，减少分歧.

3.2 不同文献之间得出结论差异很大，甚至冲突，亟待综合性的实验解决分歧.如王春[20]，黄萍萍[21]，周俊辉等[19]的实验，内容相似但得出的结论却有很大差异，在6-BA的最适浓度上没有得出统一的意见.

3.3 没有一个统一的衡量标准.在原球茎诱导、增殖分化等实验中，单纯地做视觉上横向比较，很少用数据说明问题，很难与其他人的实验结果进行系统的比较，只有少量如褐化棵数等有明确数值对比.此外，由于没有统一的衡量标准，使得很多实验结果不能直接比较，不得不在下一次实验中重新试验，导致大量重复劳动.因此石斛繁殖研究中亟需形成一套稳定可靠的衡量体系，可以简化现有的研究工作，得出较为系统的结论，使得大量的实验结果可以进行比对，缩减工作量，减少重复劳动.

3.4 石斛繁殖的研究到目前为止还只有在石斛培养基上形成一个相对权威的基础培养体系，后期研究应着眼于寻找一个明显优于其他的培养体系，并在此基础上进行细化和改进.另外保持其他非传统培养基的研究和开发，以期在非传统培养基体系中取得新突破，找到适合石斛快速繁殖的培养体系.

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ResearchesontheReproductionTechniquesofDendrobium

ZHU Han-yi,WANG Hui-zhong,XUE Da-wei

(College of Life and Environmental Sciences,Hangzhou Normal University,Hangzhou 310036,China)

Dendrobiumplants are economically important flowers in horticulture as well as the most valuable medicinal herbs with wide clinical applications in traditional Chinese medicine.However,Dendrobiumproduction can not meet the current needs of the market.To provide methods and technologies for the reproduction ofDendrobiumas well as the mentality of follow-up study,this paper gave a brief review of the reproduction technologies ofDendrobiumsummarized and compared the current reproduction technologies ofDendrobiumand analyzed the current problems in the researches onDendrobiumreproduction to find a way to improve the efficiency ofDendrobiumreproduction,protect endangeredDendrobiumand meet the market demands.

Dendrobium; reproduction techniques; tissue culture

2011-01-12

杭州市科技局科研基金项目(20091832B10).

朱涵毅(1988—)，男，江苏宜兴人，遗传学专业硕士研究生，主要从事植物分子遗传学研究.

*通信作者：薛大伟(1978—)，男，山东蒙阴人，副教授，博士，主要从事植物分子生物学研究.E-mail:dwxue@hznu.edu.cn

10.3969/j.issn.1674-232X.2011.05.012

Q945

A

1674-232X(2011)05-0449-05