反相高效液相色谱法测定醋酸甲萘氢醌片的含量＊

林 昀，龚士学，程辉跃

（重庆市药品检验所，重庆 401121）

醋酸甲萘氢醌又名维生素K4，是维生素类药，主要适用于肠道吸收不良及各种原因所致阻塞性黄疸、慢性溃疡性结肠炎等肠道吸收功能减低等造成维生素K缺乏的凝血障碍性疾病。现行标准中，醋酸甲萘氢醌片的含量测定方法为紫外分光光度法[1－3]。笔者按质量标准方法验证指导原则[1]，建立了测定醋酸甲萘氢醌片含量的反相高效液相色谱法，现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent1100型高效液相色谱仪（配有紫外检测器和二极管阵列检测器）；AgilentC18柱（250mm×4.6mm，5μm），AichromBond－AQC18柱（250mm×4.6mm，5μm），WelchMaterialsC18柱（150mm× 4.6mm，5μm）；AE 240型电子天平（瑞士梅特勒）。醋酸甲萘氢醌对照品（中国药品生物制品检定所，批号为0228－9802）；样品（3个厂家共6批，均为市售品）；乙腈为色谱纯，水为二次蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件选择

2.1.1 测定波长选择

取醋酸甲萘氢醌对照品约10 mg，用适量流动相溶解并稀释成每1 mL中含0.02 mg的溶液，照紫外－可见分光光度法[2005年版《中国药典（二部）》附录ⅣA]，在230～400 nm波长范围内扫描（图1）。结果285 nm波长处有最大吸收，故以此为测定波长。

图1 醋酸甲萘氢醌紫外扫描图谱

2.1.2 流动相选择

由于国内外药典均未收载该品种的高效液相测定方法。笔者经考察和筛选，最终决定以乙腈－水（65∶35）为流动相，柱温为室温，检测波长285 nm，流速1.0mL/min，进样量20μL。在此色谱条件下，被测物质峰与相邻杂质峰分离度良好，保留时间适中，峰纯度因子为999.0，色谱图见图2 C。

图2 高效液相色谱图

2.1.3 空白辅料影响及破坏性试验

称取按处方量配制的空白辅料（相当于1片的量），加流动相约100mL，置37℃水浴中，超声处理10min，放冷，滤过，作为空白辅料溶液。取该续滤液按上述色谱条件测定，结果见图2 B。另取本品细粉适量（约相当于醋酸甲萘氢醌20mg），分别经碱破坏、酸破坏、氧化破坏、光照破坏及热破坏后用流动相稀释成质量浓度为0.02 g/L的溶液，照上述色谱条件进样分析，在3倍主峰保留时间内，未见破坏试验产生的各杂质峰，证明本实验色谱条件可行。

2.2 溶液制备

精密称取样品（批号为080201）20片，研磨后取6份（每份相当于醋酸甲萘氢醌10mg），分别置50mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取5mL，置50mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取醋酸甲萘氢醌对照品适量，同法配制成对照品溶液。

2.3 系统耐用性试验

分别用 Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）、Aichrom-Bond－AQ C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）、Welch Materials C18柱（150mm×4.6mm，5μm）3种色谱柱按上述条件试验，结果基本一致，说明本方法的耐用性较好。可见，辅料在醋酸甲萘氢醌峰的保留时间处无干扰，对测定无影响。

2.4 方法学考察

线性范围考察与定量限确定：精密称取醋酸甲萘氢醌对照品39.71mg，置100mL量瓶中，用适量流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1.0，2.5，5.0，10.0，15.0mL，分别置100mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为4.0，10.0，20.0，40.0，60.0μg/mL的对照品溶液，进样测定，记录色谱图，以质量浓度 X对峰面积 Y进行回归，得回归方程 Y=27 001X+2.943 7，r=1.000（n=5）。结果表明，醋酸甲萘氢醌质量浓度在 4.0～60.0μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。以 S/N=10计算，本品的定量限确定为54.21 ng/mL。

精密度试验：取质量浓度为20.0μg/mL的对照品溶液，照上述色谱条件进样分析，连续5次，记录色谱图。结果峰面积的 RSD为0.04％（n=5）。

稳定性试验：取质量浓度为20.0μg/mL的供试品溶液，分别在0，1，2，4，6h时测定。结果峰面积的 RSD为0.21％（n=5），表明醋酸甲萘氢醌溶液在室温下6h内稳定。

重复性试验：取同一批样品，照上述色谱条件依法测定。结果醋酸甲萘氢醌片的平均含量为98.79％，RSD为0.91％（n=6），表明方法重复性良好。

回收率试验：分别取对照品约16，20，24 mg各3份，精密称定，分别置50mL量瓶中，加入相应辅料，用流动相适量溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，作为对照品溶液。精密量取续滤液5.0mL，置100mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μL，依法测定，计算回收率。结果见表1。

表1 醋酸甲萘氢醌回收率试验结果（n=9）

2.5 样品含量测定

取3个厂家共6批样品各2份，按本试验所用方法与2005年版药典方法分别测定含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果

3 讨论

现行质量标准中的紫外分光光度法专属性不强，易受溶剂和辅料的影响。虽有人采用高效液相色谱法测定含量[4]，但测定波长接近末端吸收，在200～400 nm波长范围内进行全波长扫描，醋酸甲萘氢醌在末端比杂质有更大的吸收，影响其他杂质的检测，而在285 nm波长处各杂质峰均有不同程度的吸收，利于主成分的含量测定，故将检测波长定在285 nm。

在流动相选择过程中，乙腈的量过少时，分析时间较长，且峰形不好，当乙腈∶水（65∶35）时，主峰与各杂质峰能很好分离，分离度大于1.5，且峰形良好。

由含量测定结果可以看出，两种方法的测定结果差异不大。但用高效液相色谱法可以有效地将主成分与杂质分开，该方法专属性强、灵敏度高、重复性好、操作简便、结果准确可靠，适用于醋酸甲萘氢醌制剂的质量控制。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[M].北京：化学工业出版社，2005：840，附录172－173.

[2]顾弟元，陈佩绵.紫外分光光度法测定维生素Kd片剂含量方法的改进[J].苏州医学院学报，1995，15（2）：372－373.

[3]郭金鹏，王英英.分光光度法测定片剂中维生素K4的含量[J].河北医学学院学报，1989，10（3）：157－158.

[4]陈建琴，郑 洁.高效液相色谱法测定醋酸甲萘氢醌片的含量[J].中国医院药学杂志，2005，25（4）：376－377.