四种预处理方法对混合菌产氢特性的影响

汪同嘉，任云利，王键吉

(河南科技大学化工与制药学院，河南洛阳471003)

0 前言

开发后续能源，保护环境，已成为当今世界的共识。生物质是一种广泛存在的可再生资源，生物质水解后可以得到木质素、纤维素和半纤维素，半纤维素水解后可以得到30% ～80%的木糖［1－2］。若能通过发酵将木糖转化为氢气或乙醇等清洁能源，则对环境和能源问题的解决具有重要的意义。酿酒酵母是工业上生产乙醇的优良菌株，但由于缺少木糖利用的最初代谢途径而不能直接利用木糖进行乙醇发酵。多年来人们试图通过基因工程和细胞融合等方法对其进行改造使之能够代谢木糖生产乙醇。然而，所得到的重组酵母或酵母工程菌均因对乙醇、乙酸或者糖浓度的较低的耐受性造成乙醇生产效率极低［3－4］。从而，将木糖转化为氢气能源的研究逐渐引起了国内外学者的关注。厌氧发酵制氢技术由于条件温和、能耗低，被认为是最有应用前景的技术之一。目前常用产氢的微生物中有单一的菌种也有混合菌种。混合菌是多种微生物的混合体，包括产氢菌和耗氢菌。在厌氧发酵过程中，产氢菌产生的氢气会很快被耗氢菌消耗，氢气产量极低。但是一些产氢菌能形成芽孢，在加热和毒性化学物质存在等不良环境下，具有比耗氢菌更强的耐受能力。因此，预处理可以起到抑制耗氢菌活性、筛选产氢菌的作用。近年来，一些学者通过热处理、酸处理、碱处理等方法来有效抑制污泥中的耗氢微生物，从而达到了强化微生物制氢之目的［5－7］。

类似于活性污泥，牛粪堆肥也是多种微生物的混合体，可用于发酵制氢。近几年，关于牛粪堆肥用作发酵制氢的菌源已有不少报道［8－9］。但是，通过对该混合菌预处理筛选产氢菌以强化产氢的报道很少［10］。牛粪用于沼气发酵后的发酵液中富含各种厌氧菌或兼性厌氧菌。因此，本文研究了取自牛粪发酵液的混合菌以木糖为碳源的产氢能力，并比较了热处理、酸处理、碱处理和红外照射处理的最佳处理条件，以及这四种预处理方法对混合菌发酵制氢的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用混合菌取自洛阳市生生乳业沼气发酵池。

1.2 培养基

培养基的组成为:木糖15 g/L，蛋白冻5 g/L，磷酸二氢钾14 g/L，磷酸氢二钾6 g/L，硫酸铵2 g/L，柠檬酸钠1 g/L，七水硫酸镁0.2 g/L。

1.3 实验方法

将95 mL培养基和5 mL处理好的混合菌倒入500 mL的发酵瓶中，在CO2吸收瓶中加入适量的NaOH溶液，分别用橡胶塞密封。将发酵瓶、CO2吸收瓶用乳胶管连接，并向发酵瓶中鼓吹N2以排出体系中的氧气。将装满水的量气管和水准瓶用乳胶管和CO2吸收瓶连接。发酵前，记下水准瓶和量气管液面相平时的量气管初始读数。然后将发酵瓶置于37℃水浴摇床，在转速为155 r/min的条件下发酵。

1.3.1 混合菌的热处理

取5根试管，分别加入8 mL混合菌液，在沸水浴中分别处理0 min、10 min、20 min、30 min、50 min和90 min，然后各取5 mL进行接种。

1.3.2 混合菌的红外照射处理

取一定量的牛粪堆肥放入培养皿中，在培养皿垂直上方8 cm处用160W的红外灯泡分别照射1 h，2 h和3 h后，取5 mL接种。

1.3.3 混合菌的酸处理

取一定量的牛粪堆肥，分为5份。用盐酸分别将其酸碱度调至pH2，pH3，pH4，pH5，pH6。在37℃恒温水浴中预处理24 h后，取5 mL接种。

1.3.4 混合菌的碱处理

取一定量的活性混合菌，分为3份。用NaOH水溶液分别将其酸碱度调至pH8，pH9，pH10。在37℃恒温水浴中预处理24 h。分别取5 mL接种。

1.4 发酵产氢动力学模型

修正的Gompertz方程能较好地描述间歇实验中微生物生长随时间的变化规律［11］，其表达式为:

式中，H为t时间内的累积产氢量，mL;P为最大累积产氢量，mL;Rm为最大产氢速率，mL/h;λ为产氢延迟时间，h。在本研究中，每隔1 h记录发酵产生的累积产氢量，用上述方程拟合得到P、Rm和λ三个参数。然后用下式［12］:

计算间歇实验中的产氢速率。

2 结果与讨论

2.1 热处理时间对混合菌产氢的影响

一些产氢菌有更好的环境耐受能力［13－15］。文献［16］从牛粪中分离得到1株极端嗜热产氢菌，可在75℃下发酵产氢;作者在前期工作中［17］，在100℃热处理活性污泥10 min后使产氢量提高了1.33倍。通过热处理可减少混合菌中的一些耗氢菌和抑氢菌(如乳酸菌)，从而强化产氢。

本实验中，经不同热处理时间处理的混合菌的产氢过程如图1所示。从图1可以看出:混合菌热处理10 min较未处理所得累计产氢量并无明显变化。然而，当混合菌热处理20～50 min再进行接种发酵所得产氢量可达310～320 mL，较未处理混合菌所得产气量提高约30%。当热处理的时间增加至90 min时，累计产氢量则显著下降。另外，热处理导致发酵初期(前5 h)产氢速率下降。当热处理时间增加至90 min时，发酵5 h后几乎检测不到氢气。

由图1所示实验数据拟合得到Rm、λ和P，拟合的相关系数R2均大于0.99。因此，累计产氢量随时间的变化关系符合Gomperts模型。拟合所得到的3个参数被用于计算间歇实验的产氢速率(如图2所示)。可见，热处理10 min的混合菌的产氢速率无明显提高;当热处理时间增加至20～50 min时，产氢速率可提高46%～85%;当热处理时间继续增加至90 min时，产氢速率下降16%。这表明时间过短的热处理对混合菌系影响不大，但过长时间使得产氢菌的生长受到了威胁。因此实验所用混合菌的热处理时间应控制在20～50 min。

2.2 红外处理时间对混合菌产氢的影响

与可见光相比，红外线具有较长的波长，较强的渗透性和较强的穿透组织的能力。远红外射线与传导加热相比，在致死温度以上，细菌的生存率显著下降。在40℃(致死温度)以下，热能越高细菌的生存率越低［18］。文献［9］将牛粪堆肥红外照射2 h获得较大的累计产氢量;文献［17］利用红外处理活性污泥1 h，所得累计产氢量提高了24.6%。

本实验对所用混合菌分别照射1 h，2 h和3 h后发酵，研究红外照射时间对混合菌产氢的影响，实验结果见图3和图4。从图3和图4可以看出:红外照射1 h后的混合菌与未照射的混合菌相比，累计产氢量未见明显变化，产氢速率略有增加。红外照射2 h的混合菌发酵的产氢速率和累计产氢量都较未处理的混合菌有一定的增强作用，其中所得累计产氢量提高约20%，产氢速率提高32%。进一步增加红外照射时间至3 h混合菌的产氢速率较照射2 h的产氢速率增加20%，但累计产氢量呈现下降趋势。这说明1 h的红外照射时间对于混合菌生态系未造成很大影响;增加红外照射的时间至2 h，耗氢菌等一些高热能细菌生存率下降，从而使产氢速率和产氢量都得到提高。但继续增加红外照射时间，产氢菌的生存也会受到威胁。

2.3 酸处理对混合菌产氢的影响

取自沼气发酵池中的混合菌含有大量的产甲烷微生物，这些微生物适宜在中性或微碱性的环境中生长繁殖。产甲烷微生物的最适pH值为6.5～7.5，酸性(pH＜6.0)和碱性(pH＞8.0)环境对产甲烷微生物都是不利的。与产甲烷微生物不同的是，很多种产氢菌是耐酸的。例如，文献［19］筛选得到1株高效厌氧产氢细菌B49，在pH 3.3仍能生长，最适pH值为3.9～4.2;文献［20］筛选到1株遗传性状稳定的高产氢耐酸突变株，在pH 3.0时仍能生长。通过酸性预处理，可以抑制耗氢菌［21］和产甲烷菌。

从图5和图6可以看出:酸处理对产氢延迟时间几乎没有影响，但对累计产氢量和产氢速率有一定程度的影响。与未处理的混合菌相比，在pH为3～5的条件下处理的混合菌发酵所得累计产氢量可提高10%～20%。酸处理对产氢速率也有一定的影响，在pH=3条件下处理的混合菌的产氢速率较未处理时提高约39%。继续增加H+的浓度，在pH=1条件下处理的混合菌的累计产氢量和产氢速率则明显下降。这是因为在较强的酸性环境中，产氢菌受到了融胞的威胁。与未处理的混合菌的发酵产氢过程相比，在pH=6的条件下预处理混合菌的产氢速率未见明显提高，这可能是过低的H+浓度对混合菌系中产氢菌和好氢菌都不能产生较大的影响所致。

2.4 碱处理对混合菌产氢的影响

从图7和图8可以看出:在pH=8的条件下处理混合菌后的产氢过程较未处理时无明显变化。但在pH=9条件下预处理混合菌所得产氢速率和累计产氢量分别达到22.6 mL/h和320 mL，较未预处理时分别提高83%和33%。在pH=10的条件下预处理牛粪堆肥较pH=9的条件下预处理的产氢速率和累计产氢量均有下降。分析以上现象，这是由于较高的OH－浓度使得细胞膜中的蛋白质水解从而破坏了细胞膜的结构，导致细胞的酶系和结构受到损害甚至分解菌体中的糖类，使耐受OH－能力较差的细胞(主要为一些耗氢菌)失活，并使其胞内物质释放到周围环境中，此时的产氢量和产氢速率都有较大提高。当pH超过10时，过高的OH－浓度使产氢菌也受到了一定程度的威胁，从而提前进入衰亡期，产氢量和产氢速率都有下降。

3 结论

本文的研究结果表明:热处理、碱处理、酸处理和红外处理对产氢的延迟时间影响较小，但对产氢量和产氢速率均有一定程度的提高，且产氢量与发酵时间的关系均符合Gompertz模型。不过，由于不同的预处理条件对混合菌系的组成有着不同的影响，因此对产氢过程的影响也不相同。其中，热处理和碱处理对混合菌发酵的累计产氢量和产氢速率的提高程度较大，红外照射处理和酸处理对混合菌发酵产氢的影响相对较弱。最佳的热处理条件为100℃，20～50 min，在该条件下累计产氢量和最大产氢速率较未处理时分别提高约30%和46%～85%。最佳的碱处理条件为pH=9，时间为24 h，在该条件下累计产氢量和产氢速率分别提高33%和83%。最佳的红外照射处理条件为照射2～3 h，最佳的酸处理条件为pH=3～5，时间为24 h。

［1］ Xu F，Liu C F，Geng Z C，et al.Characterisation of Degraded Organosolv Hemicelluloses from Wheat Straw［J］.Polymer Degradation and Stability，2006，91(8):1880－1886.

［2］ Xu F，Geng Z C，Sun J X，et al.Fractional and Structural Characterization of Hemicelluloses from Perennial Ryegrass (Lolium Perenne)and Cocksfoot Grass(Dactylis Glomerata)［J］.Carbohydrate Research，2006，341(12):2073－2082.

［3］ Mohagheghi A，Evans K，Chou Y C，et al.Cofermentation of Glucose，Xylose，and Arabinose by Genomic DNA－integrated Xylose/Arabinose Fermenting Strain of ZymomonasMobilis AX101［J］.Appl Biochem Biotechnol，2002，98:885－895.

［4］ Marie J，Björn J，Bärbel H H，et al.Reduces Oxidative Pentose Pathway Flux in Recombinant Xylose－utilizing Saccharomyces cerevisiae Strains Improves the Ethanol Yield from Xylose［J］.Appl Environ Microbiol，2002，68(4):1604－1609.

［5］ Yang M，Yu H Q，Wang G.Evaluation of Three Methods for Enriching H2－producing Cultures from Anaerobic Sludge［J］.Enzyme and Microbial Technology，2007，40(4):947－953.

［6］ Chen CC，Lin Y Y，Lin M C.Acid－base Enrichment Enhances Anaerobic Hydrogen Production Process［J］.ApplMicrobiol Biotechno1，2002，58(2):224－228.

［7］ Kawagoshi Yasunori，Hino Naoe，Fujimoto Aya，et al.Effect of Inoculum Conditioning on Hydrogen Fermentation and pH Effect on Bacterial Community Relevant to Hydrogen Production［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2005，100 (5):524－530.

［8］ Ren N Q，Xu JF，Gao L F，et al.Fermentative Bio－hydrogen Production from Cellulose by Cow Dung Compost Enriched Cultures［J］.International Journal of Hydrogen Energy，2010，35(7):2742－2746.

［9］ Fan Y T，Zhang G S，Guo X Y，et al.Biohydrogen Production from Beer Lees Biomass by Cow Dung Compost［J］.Biomass Bioenergy，2006，30(5):493－496.

［10］ Fan Y T，Zhang Y H，Zhang SF，et al.Efficient Conversion of Wheat Straw Wastes into Biohydrogen Gas by Cow Dung Compost［J］.Bioresource Technology，2006，97(3):500－505.

［11］ Yang M，Wang G，Yu H Q.Kinetic Modeling of Batch Hydrogen Production Process by Mixed Anaerobic Cultures［J］.Bioresource Technology，2006，97(11):1302－1307.

［12］ 万伟，王建.利用动力学模型探讨底物浓度对生物产氢的影响［J］.中国科学B辑:化学，2008，38(8):715－720.

［13］ Fujiwara Shinsuke，Takagi Masahiro，Imanaka Tadayuki.Archaeon Pyrococcus Kodakaraensis KOD1:Application and Evolution［J］.Biotechnology Annual Review，1998，4:259－284.

［14］ Ren N Q，Cao G L，Wang A J，etal.Dark Fermentation of Xylose and Glucose Mix Using Isolated Thermoanaerobacterium Thermosaccharolyticum W16［J］.International Journal of Hydrogen Energy，2008，33(21):6124－6132.

［15］ Li S，Lai C F，Cai Y H，et al.High Efficiency Hydrogen Production from Glucose/Xylose by the Ldh－deleted Thermoanaerobacterium Strain［J］.Bioresource Technology，2010，101(22):8718－8724.

［16］ Yokoyama Hiroshi，Moriya Naoko，Ohmori Hideyuki，et al.Community Analysis of Hydrogen－producing Extreme Thermophilic Anaerobic Microflora Enriched from Cow Manurewith Five Substrates［J］.ApplMicrobiol Biotechnol，2007，77(1):213－222.

［17］ 任云利，赵爽，王键吉.预处理方法对活性污泥利用木糖产氢的影响［J］.可再生能源，2010，28(4):85－89.

［18］ 赵志军，隋继学，刘保旺.高新杀菌技术在食品工业中的应用［J］.肉类工业，2003(5):14－16.

［19］ Ren N Q，Lin M，Ma X P，et al.A Strain of Anaerobic Bacteria Screened for High Efficient Hydrogen Production and Its Aciduric Character［J］.Acta Energiae Solaris Sinica，2003，24(1):80－84.

［20］ Lu W Y，Wen JP，Chen Y，et al.Screening of Hydrogen－producing Aciduric Enterobacter Aerogenes Strain Using He－Ne Laser Irradiation［J］.Chemical Industry and Engineering Progress，2006，25(7):799－802.

［21］ 刘常青，赵由才，张江山，等.酸性预处理污泥厌氧发酵产氢［J］.环境科学学报，2008，28(10):2006－2011.