高等植物及藻类植物中cAMP研究进展

邓海临,李大鹏

(1.福建农林大学 食品科学学院,福建 福州 350002;2.中国科学院 海洋研究所,山东 青岛 266071)

Sutherland在研究肾上腺素引起肝细胞中糖原分解成葡萄糖时发现,如果使肾上腺素和分离出来的细胞膜碎片互相作用,可生成一种当时不知名的小分子物质,当把这种物质单独和肝细胞的胞浆接触时,也能引起胞浆中糖元的分解,其作用和肾上腺素作用于完整的肝细胞时类似。这说明肾上腺素并不是直接作用于糖元,而是作用于细胞膜上,促使其生成小分子物质的结果。这种小分子物质就是后来证明的cAMP(环腺苷酸)。cAMP的发现彻底改变了人们对新陈代谢调节机制的认识,人们把蛋白激酶和磷酸化作用以及去磷酸化作用调节蛋白质活性的系统归为生物信号转导中的第二信使系统之一。cAMP作为第二信使普遍存在于细菌、真核微生物、真菌以及多细胞动物,此外,对外界信号作出的一系列细胞反应都与cAMP有关。由于植物中cAMP含量通常较低,一般的检测方法难以达到要求,随着酶联免疫法、液相色谱法、质谱法等新型精确检测方法的应用,使得植物细胞中含有 cAMP得到肯定,也使海藻中cAMP的研究得到了较快的发展。

1 cAMP信号系统的组成

1.1 腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase,AC)

AC是合成cAMP的关键酶类,目前已知有9种腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase,AC)异构体。根据AC氨基酸序列,至少可分为两种亚类。各种AC异构体表达的组织特异性会影响不同组织在特异刺激下合成cAMP的量。除了由G蛋白激活,AC也能整合G蛋白的βγ亚基、蛋白激酶 C以及细胞内钙离子等转导的信号。

目前,通常使用组织化学和生物化学方法检测植物组织中的 AC活性。组织化学法主要基于标准Wachstein-Meisel法磷酸铅沉淀技术[1],以ATP作为AC的底物,用电子显微镜检测ATP形成cAMP过程中产生的 PPi与铈形成电子致密沉淀物的量来代表AC的活性。因为细胞含有大量ATP水解酶不断地释放 Pi,在这一过程中产生许多假阳性反应,很多化合物都不能避免干扰活动。后来采用对ATP酶敏感较低的 5'-三磷酸亚酰胺腺苷代替 ATP作为底物[2],运用这种方法,最早在细胞质膜中发现AC的活性。此外,在玉米根尖内质网、质膜、核膜[3]以及豌豆内膜[4]上都检测到AC活性。植物学家发现AC的许多生理作用。Rougier[5]提出AC活性是杨树花粉管稳定形成的重要因素,Curvetto[6]在蚕豆保卫细胞中定位了AC活性是由IAA、Ca2+、咖啡因、GTP等激活的。作者认为在一定程度上 cAMP参与了气孔运动中由G蛋白引起的 IAA信号转导体系。此外,在菜豆初生叶的细胞质膜外和类囊体膜中也发现了 AC的活性,另一项研究通过免疫定位在叶绿体和细胞壁中发现了cAMP[7]。

组织化学方法难以精确定位AC活性,只能揭示其在生理过程中有一定的作用。生物化学方法实际上是用放射性同位素标记cAMP的前体(ATP或者5'-三磷酸亚酰胺腺苷)测定合成放射性具有cAMP的含量来检测AC的活性。不过早期的研究因无法检测新合成的化合物而遭到质疑,随着更加精确的分离技术的发展,生物化学方法提供更加可靠的证据。例如,Carricarte[8]初步估计了苜蓿(Medicago sativaL.)中水溶性AC的分子质量为84 ku,并发现AC的活性依赖于 Ca/CaM 与 G蛋白的功能无关。相比之下,Lusini[9]在蓖麻根中检测到 AC的活性。酶活性大约在20 pmol/(min·mg),而AC的活性与G蛋白和NaF有关,AC可能受 G蛋白调控。运用质谱分析技术Pacini[10]在豌豆中检测到AC活性。AC用Mg2+-ATP作为底物合成cAMP,AC的活性与GTP存在很大关联。低浓度的GTP激活AC活性,而过高浓度的GTP抑制其活性,这可能是因为与 ATP竞争造成的。Cooke[11]在研究紫花苜蓿细胞组织时发现,植物黄萎病致病菌激发AC的活性。AC的活性依赖于Mg2+由 Ca2+激发。较低活性的 AC在加入植物黄萎病致病菌后,AC活性瞬间升高了3倍。AC活性的短暂性升高同时伴随着细胞内 cAMP含量升高,随后磷酸二酯酶活性快速升高。

1.2 磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)

磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)负责降解细胞内 cAM P,目前已知有 40种以上 PDE,可分为七类。某些组织中AC基础活性很高,这时PDE在调节cAMP信号途径中的作用就很重要了。除了可以活化已有的 PDE酶类, cAMP也诱导合成新的 PDE mRNA,但目前这种调控节的分子机制尚未明了。

早在高等植物中提取环核苷酸混合物的报道之前,Wood[12-13]在豌豆苗种发现cAMP被PDE水解成AMP,随后在烟草、胡萝卜叶、大麦种子、马铃薯、洋姜块茎中发现了 PDE的活性。诸多的研究表明,cAMP是植物组织中内源性物质,其拥有的功能与其他生物体中类似。与此不同的是,Lin等[14]在豌豆苗中发现PDE活性具有最佳pH,并且对甲基黄嘌呤不敏感,水解得到3'-AMP而不是5'-AMP。更重要的是,把RNA分解中间物2',3'-cAMP作为底物而不是第二信使系统中的3',5'-cAMP。因为在动物体中PDE作用于cAMP第二信使系统只产生5'-AMP并不水解2',3'-cAMP,由此推断出豌豆中的PDE并不在植物信号转导中发挥作用,只是作为RNA分解代谢的一部分。

1.3 蛋白激酶 A(cAMP-dependent protein kinase A,PKA)

PKA全酶是一种四聚体,由两个催化亚基(C)和两个调节亚基(R)构成。在没有 cAMP时,以钝化复合体形式存在。cAMP与调节亚基结合,改变调节亚基构象,使调节亚基和催化亚基解离,释放出催化亚基。活化的蛋白激酶A催化亚基可使细胞内某些蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化,于是改变这些蛋白的活性,进一步影响到相关基因的表达。

在真核生物中,cAMP的功能主要是由蛋白激酶对靶蛋白的磷酸化实现的。但近来又有实验证明cAMP 可以直接作用于离子通道。目前,植物细胞中的研究主要集中在对 cAMP依赖型蛋白激酶的查寻上。虽然尚未从植物组织中纯化出 cAMP依赖的蛋白激酶 A,但在多种植物的提取物中证明依赖于cAMP磷酸化作用是存在的,如浮萍、玉米、椰子和水稻等[15-17]。现已在几种植物中发现有类似动物PKA 的调节亚基(即 cAMP 的结合蛋白)和催化亚基。而且近年来报道的几个植物蛋白激酶基因与动物中PKA和蛋白激酶C (protein kinase C,PKC)催化亚基高度同源[17-18]。虽然植物与动物PKA 的催化亚基相似,cAMP 能激活 PKA 的催化亚基,但并不能完成调节亚基的抑制作用,所以植物体内可能还需其他酶的协助功能完成PKA 的调节功能。

1.4 cAMP调控的离子通道(cyclic nucleotide-gated channels)

在植物中建立以蛋白激酶A为主要目标和因素研究环核苷酸信使系统存在一定的困难,植物中cAMP调控的离子通道(CNGCs)是研究环腺苷酸信使系统的理想体系[19]。CNGCs是许多植物中一组运输蛋白质的离子通道,另外其只由环腺苷酸激活。拟南芥CNGCs中就存在至少20种基因[20]。

通过对CNGCs的功能分析发现,拟南芥中胞外高浓度的 Ca2+抑制 K+的运动来调控 K+、Ca2+和其他一价阳离子的运动,并且对 K+、Ca2+的调控都依赖于cAMP和cGMP[21]。除此之外,植物CNGCs含有相同的钙调蛋白结合域(CaMBD),但是不同的CNGCs拥有不同的钙调蛋白结合能力[22]。然而钙调蛋白与CNGCs的结合依赖于Ca2+并由cAMP激活。因此,Ca2+与钙调蛋白和环核苷酸的相互作用彼此相关联,另外CNGCs与胞内钙调蛋白和环核苷酸信号共同形成胞内信号转导通路。

环核苷酸和离子通道共同参与了植物体内众多生理活动。根据Kurosaki[23]的研究显示,cAMP直接调控K+通道,K+受cAMP激发流入胡萝卜细胞内同时伴随着 Ca2+的快速转移,此外还有进一步的研究显示出cAMP和cGMP在调控气孔开启具有一定的作用,这涉及了多组离子通道。双丁酰cAMP引起百合花粉管中胞内 Ca2+浓度的升高,光解释放 cAMP使花粉管顶端弯曲,并使储存Ca2+的释放。Ca2+的分布迁移是控制顶端生长的一个重要原因,而 cAMP是调节 Ca2+分布的主要因素[24]。这些通道涉及的离子运动是否是CNGCs还不能确定,cAMP是直接或是间接影响离子通道的活性,影响它们的磷酸化也尚不明确,这些都需要进一步的研究。

2 cAMP的生理功能

在植物界中,对海藻的研究给我们提供了较好的研究 cAMP生理功能的材料,例如 cAMP调控衣藻(Chlamydomonas eugametos)有性生殖和纤细裸藻的生理节奏。在海藻的研究中发现 cAMP的合成和分解机理,最近已经从纤细裸藻(Euglena gracilis)中成功克隆 cAMP蛋白激酶基因[25]。尽管植物细胞中cAMP信号系统的某些成分在基因水平上尚未分离,但研究表明cAMP具有多种生理功能。与cAMP相关的生理功能的相继发现,为植物细胞中存在cAMP信号途径积累了越来越多的实验证据。

细胞内cAMP的变化及cAMP相关酶生理作用的报告显示,植物当中大量的生理活动都与 cAMP的变化有关[26-28]。人们发现 cAMP在多种植物生理活动发挥作用例如离子传输。cAMP在叶绿体中也显示具有重要的作用,目前已经发现 cAMP在该细胞器中完整的运行机制。

2.1 调节植物细胞生理周期

研究发现,cAMP在众多生理过程中发挥极其重要的作用。Ehsan[29]报道cAMP与烟草BY-2细胞的细胞分裂周期密切相关。细胞在S期时,cAMP的含量达到最高在G1期时含量相对较低。在加入吲哚美辛(一种腺苷酸环化酶抑制剂)之后[30],引起细胞S期cAMP含量的降低,并伴随减弱细胞的有丝分裂。作者认为在细胞分裂过程中存在一种前列腺素或前列腺素类似物(素馨酮酸)激活腺苷酸环化酶。

越来越多的研究显示 cAMP在动物及真菌细胞分裂周期中发挥重要作用。cAMP含量在连续的细胞分裂周期中发生变化,在不同细胞类型中 cAMP显示出具有刺激或抑制细胞增值的作用。在细胞 S期之前,cAMP含量的瞬时升高是引起DNA合成的原因之一。这说明 cAMP作用于细胞分裂过程中重要的细胞分裂调解素。酿酒酵母细胞分裂周期也受到Ras/cAMP信号转导途径的高度调控[31]。

cAMP在调节纤细裸藻(Euglena gracilis)细胞生理节奏发挥重要的作用[32-33]。Edmunds[34]认为通过G1/S和G2/M的协调转变从而形成生物钟和细胞分裂周期之间的联系。一项腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶的研究显示,AC活性的变化受到其酶活性调节器的调节而不受酶数量的影响。在白天的任何时候加入毛喉素(forskolin)都能最大程度的激活腺苷酸环化酶活性,此外还能减小 cAMP含量变化的幅度以及减少细胞分裂过程中的节律性。IBMX的实验发现磷酸二酯酶活性受时间段的抑制。然而,IMBX也是各种磷酸二酯酶活性的抑制剂,只是程度上各不相同而已。正是由于这个原因导致细胞周期中存在各种磷酸二酯酶,其中某种特别的磷酸二酯酶可能是cAMP变化产生的原因。

在研究生物钟影响cAMP含量的过程中,Tong[35]研究了Ca2+、钙调蛋白、三磷酸肌醇和 cGMP在腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶中的调节作用。cGMP含量的变化先与 cAMP含量变化。cGMP及其类似物同样对腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶存在一定的影响。因此可以看出cGMP是cAMP代谢的调节者。

cAMP对细胞分裂周期产生的影响主要是延缓或加速细胞周期。在细胞生物钟的白天时段加入cAMP会导致细胞分裂周期的延缓,而在夜晚时段加入 cAMP则会加速细胞分裂周期的循环。这主要是由于细胞中存在多种不同的 cAMP受体选择性的调节一个或多个调控途径所致。在纤细裸藻中发现两种cAMP蛋白激酶(cPKA和cPKB)与cAMP及其类似物联系各不相同[36]。通过 Edmunds[34]的实验发现,cAMP含量的增加会抑制DNA的合成,使细胞分裂停留在G2期,因此抑制了细胞分裂。当cAMP含量减少的时候,对细胞分裂的抑制现象消失了。我们推测细胞分裂周期从G2到M的转变及整个有丝分裂过程都受 cAMP的影响。cAMP对细胞分裂周期的延缓作用受 cPKA调控,对细胞周期的加速作用则由cPKB调控。由此可见,cPKA和cPKB在细胞分裂周期中的表达有所不同,至于在什么时段表达什么蛋白激酶还在研究当中[37]。

2.2 参与植物抗病

许多研究显示植物在抗病毒过程中受 cAMP的调控。这种应激反应系统和动物第二信使系统中的胞外信号、信号受体、及其反应机制类似[38]。已发现多种胞外诱导子,包括多糖、低聚糖、脂肪酸、蛋白质和糖蛋白;另外还发现了少数信号受体,都是一些分布在细胞质膜上的蛋白质。信号受体对外界刺激做出的反应的同时激活特殊的防御反应基因,并诱导植物抗毒素的合成酶的产生。细胞质膜这种接收信号的机制转接到核基因,已经多方面的运用到Ca、素馨酮酸、活性氧、甘油二酯和磷酸肌醇、cAMP[39]。

Oguni首次在甘薯中发现 cAMP调控细胞防御体系合成植物抗毒素[40],之后在胡萝卜中也发现植物抗毒素的增加伴随着细胞内 cAMP含量的升高[41]。研究表明,cAMP参与了苜蓿(Medicago sativaL.)抗黄萎病合成植物抗毒素所作出的应激反应[42],苯基丙氨酸解氨酶(PAL)的活性也大幅提高催化植物抗毒素合成的前期反应。经过双丁酰 cAMP处理的苜蓿幼苗苯基丙氨酸解氨酶活性提高,并促进美迪紫檀素(medicarpin)的合成[43,11];通过 FAB/MIKE光谱分析发现在细胞内源性 cAMP在经病原激发子处理后含量升高了 4～5倍。虽然在胡萝卜细胞中也发现了上面类似的现象,但是苜蓿幼苗经病原激发子处理后3～5 min cAMP含量就达到了最高水平,而胡萝卜则在 30 min后才体现出 cAMP含量的升高,四季豆需要15min达到最高反应水平[44]。在苜蓿中,AC刺激反应的增强和减弱都随着磷酸二酯酶的变化而变化。胡萝卜中霍乱毒素刺激其植物抗毒素的合成以及激发四季豆中苯基丙氨酸解氨酶的活性与都G蛋白有关[45]。

以上的研究显示 cAMP与植物合成抗毒素反应的过程,但是究竟如何调控植物抗毒素合成还不明确。AC对Ca2+的敏感性[11]以及cAMP对离子通道的调控作用[23],均显示cAMP的作用是通过AC/cAMP和IP3/ Ca2+途径的对话而起作用的。尽管在胡萝卜细胞中没有明显的检测到对 cAMP响应的蛋白激酶活性,但是Ca2+和钙调蛋白可以快速激活。根据这些结果,我们可以推测,病原激发子诱导的cAMP增加可引起 Ca2+的内流,Ca2+再进一步激活蛋白激酶的活性[24]。

2.3 对藻类有性生殖过程的调控

Pasquale等[46]在研究莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhaidtii)雌雄配子粘合过程中发现胞内cAMP含量短暂性的升高了10倍,在单一生殖性型配子中加入外源性双丁酰 cAMP之后可以引起雌雄配子粘合时产生的相似反应,如细胞壁的消失,鞭毛顶端的激活等。并且加入环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂后加强外源性 cAMP的促进作用,在配子细胞和鞭毛中发现了腺苷酸环化酶的活性。类似的 Pijst[47]在研究卵配衣藻正负生殖型的配子混合在一起时,在粘着发生20s后观察到细胞内cAMP含量快速升高,并且把一生殖型的配子中加入另一种生殖型的配子的离体的鞭毛时也能引起细胞内 cAMP数量的短暂性的升高。由于这种 cAMP浓度的提高先于细胞融合时所有形态学和生理学的改变,推测它可能是由性粘着诱导的第一个主要的反应。Gilles[48]分别用结合蛋白实验和高效液相色谱法分析了团藻性组织细胞中的cAMP含量比普通组织细胞中高,发现过高浓度的cAMP会抑制有性生殖的性诱导,性组织的细胞仅当结合时,cAMP 浓度才会升高。在非诱雄性藻株中10倍或20倍的cAMP 浓度升高会导致其不育,由此可见 cAMP作为复杂的性诱导物质中的一员在细胞基质中发生作用。

3 cAMP含量变化机制的研究

cAMP系统的机能活动的研究主要是通过对内源性 cAMP含量的检测来实现的。早前运用较广泛的是Gilman的蛋白结合检测法,这种方法基于同位素标记的 cAMP(8-3H-cAMP)与环核苷酸样品共同竞争特异结合蛋白,cAMP蛋白激酶就是这种特异蛋白之一[49]。放射免疫检测法也是常用的方法,抗体结合过量标记的抗原,通过检测未标记的抗原取代标记的具有放射性的抗原的数量来计算 cAMP的含量。质谱、高效液相色谱及其他生物荧光方法就显得相对复杂,但是能较好地追踪活体细胞中 cAMP的变化[50]。此外酶免疫检测法则使用的相对更少,标记与未标记抗原共同竞争多克隆抗体,反应完全之后加入到含有碱性磷酸酶标记的第二抗体的平板中,酶活力的大小就反映所检测 cAMP的浓度[51]。这些技术运用得出的大量数据为植物体内 cAMP系统的研究积累了充足的证据。

cAMP作为第二信使并能引起相应的反应在植物细胞中普遍存在,当细胞受到外界刺激时,胞外信号分子首先与受体结合形成复合体,然后激活细胞膜上的 Gs-蛋白,被激活的 Gs-蛋白再激活细胞膜上的腺苷酸环化酶(AC),催化 ATP脱去一个焦磷酸而生成 cAMP。生成的 cAMP作为第二信使通过激活PKA(cAMP依赖性蛋白激酶),使靶细胞蛋白磷酸化,从而调节细胞反应,cAMP最终又被磷酸二酯酶(PDE)水解成5’-AMP而失活。AC和PDE可以从两个不同方面调节细胞内cAMP浓度,从而影响细胞、组织、器官的功能。当AC的活性升高时,cAMP浓度升高,当PDE浓度增高时,cAMP浓度降低。PDE对cAMP的调控,不仅取决于PDE的活化、抑制因素,还与细胞内PDE的组成、亚细胞分布有关。

Goodenough[52]在研究cAMP对衣藻鞭毛雌雄配子粘合作用时,发现雌雄配子粘合引起凝集素的相互作用,并最终导致 cAMP含量的升高。此外Kooijman[53]将麦胚凝集素加入到衣藻中促使雌雄配子鞭毛粘合,鞭毛上的锚蛋白(可能通过G蛋白)激活腺苷酸环化酶催化 ATP形成 cAMP。Francisco[54]在研究光调节几种大型海藻(网地藻、石花菜、石莼)cAMP含量时发现,这几种海藻在红光和远红外光的照射下,并未发生光敏反应 cAMP含量有一定的升高,在白光照射下cAMP含量大幅升高,在一定范围内 cAMP含量随着光照强度升高而升高,因此他们推测其 cAMP含量的积累受光合效能的调节,而不受光敏素的影响。由此可以看出,cAMP很大程度上受新陈代谢产生的 ATP的影响,而光合作用产生cAMP的前体例如ATP,但是cAMP含量的降低是否与ATP合成的抑制有关还不能确定。

4 小结

综上所述 cAMP信使系统是生物体调控众多生理过程的主要信息传递系统,调节活动过程中出现细胞内的 cAMP含量的变化,证明了 cAMP在调节机体整体活动的协调性和精确性等方面所起的主要作用。目前对藻类细胞内的 cAMP信使系统研究较少,只集中在几种衣藻和单细胞微藻当中;此外,对于 cAMP的研究只仅限于其含量变化,对 cAMP的相关酶及其结合蛋白的研究则几乎为零,因此对cAMP的调控机制还需要进行广泛而系统的研究。除了检测生理过程中cAMP和cAMP相关酶活性的波动变化之外,对cAMP响应的蛋白激酶、结合蛋白和他们的靶目标将是今后研究的主要重点。另外,质谱、生化分析、免疫组织化学技术、结合高压冷冻技术及分子蒸馏法的运用将有助于 cAMP和 cAMP结合位点的亚细胞定位,用细胞化学分析方法对AC酶进行定位;采用分子生物学技术分析 AC和 PDE的基因结构,用反义或RNA干扰技术抑制这些酶控制的 cAMP瞬间升高变化,同时用 cAMP类似物调控激酶或cAMP 结合位点的活性等。

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