一株柯萨奇病毒B组5型(Cox.B5)病毒的分离及VP1基因分析

李 华 杨卉娟 柯华昕 陈俊英 潘 玥 赵玉娇 孙强明 马绍辉

柯萨奇病毒B5(coxsackie virus B5，CVB5)感染可引起多种人类疾病，包括无菌性脑膜炎、肌肉麻痹、病毒性心肌炎、手足口病、胰腺炎和糖尿病等，在我国均有报道［1～4］。

CVB5属于肠道病毒属小核糖核酸病毒，无包膜、单股正链RNA，病毒基因组由7402个碱基构成，基因组顺序依次为5'端非编码区，P1、P2、P3区和一段3'端非编码区，其中P1区编码病毒的主要结构蛋白，即衣壳蛋白(capsule protein)，分别为VP1、VP2、VP3和VP4，而病毒主要的免疫原性蛋白和中和抗原位点在VP1上［1，3～5］。

为了解2009年引起无菌性脑膜炎的病原分离株KMA193－09(基因登陆号为HQ423145)的遗传特性，我们对其VP1基因片段进行扩增及分析，现将结果报道如下。

材料与方法

1.材料:(1)细胞:Hep－2、RD细胞皆由中国医学科学院医学生物学研究所检定室保存并提供。(2)标本来源:昆明市儿童医院脑炎疑似病例(年龄)的粪便标本。(3)RNA提取试剂盒:Axygen Body Fluid viral DNA/RNA Miniprep Kit.lot: KC50090501－B－G。(4)RT－PCR Kit:TAKARA One step RT－PCR Kit VER.2203.lot:BK1101。

2.方法:(1)病毒分离::采用组织培养法，取粪便标本1g，加入5ml0.01mol/L PBS(pH7.4)制成悬液，3000r/min，离心30min，用0.45μl滤器除菌过滤，接种已长成致密单层的Hep－2、RD细胞，细胞培养严格按WHO分离肠道病毒规程操作，于37℃培养，培养液为含10%小牛血清的MEM［6］。观察病毒在细胞上的细胞病变情况(CPE)，如果无CPE，盲传3代;3代后无CPE出现，判为阴性。病毒继续在RD细胞培养增殖2代。(2)病毒核糖核酸(RNA)提取:采用Axygen Body Fluid viral DNA/RNA Miniprep Kit，按试剂盒说明书提取病毒RNA。(3)引物:扩增与测序引物参照文献［7］:肠道病毒公用引物见表1。扩增片段长度为831bp，引物由上海生物工程有限公司合成。(4)反转录－聚合酶链反应(RT－PCR):采用TaKaRa公司生产的One－step RNA PCR kit(AMV)试剂盒。反应条件:50℃ 30min，反转录 95℃ 2min后94℃ 30s，51℃ 30s，72℃ 1.5min，循环39次，72℃延伸7min，然后转入4℃。取扩增产物5μl，用1.0%琼脂糖电泳，根据Marker位置对扩增片段进行确认。(5)序列测定和数据分析:扩增阳性的PCR产物由北京三博生物技术有限公司进行纯化和序列测定。其他有关CVB5的VP1序列从NCBI的基因数据库(Genbank)上下载，并采用玛格。Mega 4.0软件对测序结果进行分析处理。

表1 用于RT－PCR的引物

结果

1.病毒分离:将直接从临床样品中鉴定为CVB5的3例无菌性脑膜炎患儿的粪便标本，分别接种RD和Hep－2细胞后，仅培养分离到一个阳性分离物，收集上清，并保存在－70℃。

2.病毒分离株VP1序列测定:将阳性培养物上清，采用特异性引物作RT－PCR扩增，均能扩增出柯萨奇B5病毒的831bp特异性核酸片段;对PCR产物进行基因序列的测定，将结果输入 Genbank，用BLAST检索比对，进一步证实该分离株为柯萨奇B5病毒。

3.柯萨奇B5病毒分离株VP1基因核苷酸和氨基酸分析:VP1基因核苷酸和氨基酸同源性比较分别显示:KMA193－9与其他Cox.B5病毒分离株核苷酸同源性在85.4% ～95.7%之间，氨基酸同源性在95.67%～98.19%之间(表2)。KMA193－9在氨基酸上与其他分离株存在5个位点的差异，它们分别是3号位点由P变为T、95位点由S变为N、164位点由S变为T、188位点由G变为C、200位点由R变为K (图1)。

表2 KMA193－09分离株VP1基因核苷酸和氨基酸同源性比较(%)

4.柯萨奇B5病毒分离株VP1基因进化树分析:将不同时期、不同国家和地区的柯萨奇B5病毒采用DNAStar软件，构建基因系统进化树(图2)。结果显示，KMA193－09分离株(基因登录号HQ423144)与YZ081－SD－CHN－2005－CB5株形成一进化分支。与我国的其余柯萨奇B5分离株有一定的距离，与CB5－SD－sewage－090705－2－3H分离株共同形成一个较大的分支，而与1603Finland82株、CF219051－06株距离远。

图1 KMA193－09分离株VP1区氨基酸序列比较

图2 KMA193－09病毒分离株VP1基因进化树

讨论

肠道病毒的VP1基因不仅是病毒的主要表面抗原的决定簇区，而且具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性，目前作为肠道病毒属内不同血清型分类依据，以及小RNA病毒科内不同属的分类参考。因此选择CVB5 VP1区来分析病毒变异和进化关系。

本次CVB5病毒分离中，首先用RT－PCR方法检测采集的临床样品，由于RT－PCR方法具有快速、灵敏、特异等特点，所以检测出3个CVB5病毒样品［8，9］。当接种Hep－2、RD细胞后，仅分离得到一株CVB5病毒，提示PCR法比细胞分离更灵敏，这与文献［10］报道的一致。

通过对KMA193－09病毒分离株VP1基因进行系统发生进化树图可以看出，KMA193－09病毒分离株与中国及其他亚洲的病毒分离株距离较近，而与芬兰、法国等分离株距离较远。而序列分析也显示，KMA193－09分离株与其他中国分离株之间也显示出一定差异。以上这提示CVB5病毒存在明显的地域分布性。

曾有报道CVB5病毒在鼠胰腺连续传代15代，发现表型发生改变并引起小鼠似糖尿病综合征，而亲代病毒损害腺泡组织有限却3天后胰腺感染迹象消失［11］。通过测序和分析发现全基因序列出10个突变，导致8个氨基酸突变，其中在VP1出现N95S突变;而后研究人员进一步通过反向遗传学发现VP1氨基酸V 94 I突变使CVB5更好适应胰岛β细胞株MIN－6细胞，认为该位点更重要［11］。而本研究中KMA193－09 VP1的94和95位氨基酸分别为I及N，这提示该分离株也能较好的在MIN－6细胞增殖。

另外，CVB5病毒在VP1的288位氨基酸，除CF219051－06为赖氨酸(K)外，KMA193－09与其他病毒分离株均为谷氨酸(E)，该位置位于病毒体的表面，赖氨酸为碱性氨基酸，而谷氨酸为酸性氨基酸，这种突变的改变是否影响病毒吸附于细胞表面还有待于进一步的研究［8］。

本研究阐明了CVB5病毒KMA193－09分离株结构蛋白VP1的基因序列，并对其变异性及与其他CVB5的关系进行了分析，为今后CVB5的基因库和分子流行病的调查研究提供一定的资料及试验依据。

1 金奇.医学分子病毒学［M］.北京:科学出版社，2001:579－602

2 赵国华，许汴利，朱谦，等.一起柯萨奇B5病毒感染引起疾病暴发的流行病学调查［J］.中国初级卫生保健，2006，20(8):25－26

3 葛琼，严菊英，龚黎明，等.浙江省2008年病毒性脑膜脑炎病原柯萨奇B组5型病毒VP1区基因变异分析［J］.中国疫苗和免疫，2010，16(1):38－43

4 赵月萍，马明英，王建军，等.一起爆发型柯萨奇病毒性脑炎的病原分离与鉴定［J］.安徽预防医学杂志，2001，7(6):401－402

5 颜谨，柯昌文，郑焕英，等.基于VP4基因扩增和序列测定快速检测鉴别人肠道病毒的研究［J］.中国计划免疫，2006，12(6):469－471

6 世界卫生组织(WHO)扩大免疫规划和传染性疾病部.脊髓灰质炎病毒检测手册［R］.1992

7 Oberste MS，Maher K，Williams AJ，et al.Species－specific RT－PCR amplification of human enteroviruses:a tool for rapid species identification of uncharacterized enteroviruses［J］.Gen Virol，2006，87(1): 119－128

8 Papa A，Dumaidi K，Franzidou F，et al.Genetic variation of coxsackie virus B5 strains associated with aseptic meningitis in Greece.［J］.Clinical Microbiology and Infection，2006，12(7):688－691

9 Audrey Mirand，Christine Archimbaud，Ce'cile Henquell，et al.Prospective identification of HEV－B enteroviruses during the 2005 outbreak［J］.Journal of Medical Virology，2006，78:1624－1634

10 Mark H，Sawyer MD.Enterovirus infections:diagnosis and treatment［J］.Current Opinion in Pediatrics，2001，13:65－69

11 Al－Hello H，Davydova B，Smura T，et al.Phenotypic and genetic changes in coxsackievirus B5 following repeated passage inmouse pancreas in vivo［J］.Med Virol，2005，75(4):566－574