不同芽孢杆菌对雏鸡细菌性腹泻病原菌的体外抑菌试验

陈 亮 黄 亮 李静琴

不同芽孢杆菌对雏鸡细菌性腹泻病原菌的体外抑菌试验

陈 亮 黄 亮 李静琴

研究不同芽孢杆菌对雏鸡细菌性腹泻病原菌的体外抑菌作用。采用稀释分离法从不同来源的样品中分离得到芽孢杆菌菌株41株；以3种雏鸡细菌性腹泻病原菌为指示菌，采用牛津杯法进行体外抑菌试验，发现6株菌株对病原菌均具有明显的体外抑菌作用，抑菌效果最好的为菌株B332，其次为菌株D4；经形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析，菌株D4和B332应分别归属于巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。

芽孢杆菌；雏鸡；细菌性腹泻；抑菌作用

鸡腹泻是一类可引起鸡拉稀、下痢疾病的总称，可导致鸡食欲减退、生长受阻或停滞、产蛋量明显下降甚至死亡等。该病发生率高，一般在10%～30%，且死亡率高，长期以来一直困扰着养鸡业的发展，造成了巨大的经济损失。现有研究表明，细菌性因素是引起雏鸡腹泻的主要原因，病原菌以鸡致病性大肠杆菌(Escherichia coli)、鸡白痢沙门氏菌(Salmonellosis avium)和鸡志贺氏菌(Shigella spp.)等最为常见(甘孟侯,1999;张丁华等,2010)。目前，治疗鸡细菌性腹泻主要依赖于抗生素的使用，但由于长期不合理使用抗生素，已经导致出现强耐药病原菌和抗生素残留超标等严重问题。随着人民对食品安全的日益关注，探索新的防治方法势在必行。本试验从微生态理论角度出发，从不同来源的样品中分离芽孢杆菌，并具体研究其对雏鸡细菌性腹泻病原菌的体外抑菌作用，以期为芽孢杆菌用于预防治疗雏鸡细菌性腹泻病原菌和禽用微生态制剂的开发提供理论依据。

1 材料

1.1 样品

青海野生高原牦牛牛粪、陕西省苹果园根际土壤、郑州本地养鸡场健康鸡肠道内容物。

1.2 菌株和培养基

芽孢杆菌菌株分离自上述3种样品；鸡致病性大肠杆菌(Escherichia coli,E)、鸡白痢沙门氏菌(Salmonellosis avium,SA)和鸡志贺氏菌(Shigella spp.,SS)，购自中国兽药监察所。营养琼脂培养基(NA)用于菌株的分离、培养、保存，营养肉汤培养基(NB)用于菌株的液体培养。

1.3 器材

生化培养箱、恒温摇床、高速冷冻离心机、旋转蒸发仪、显微镜、牛津杯等。

2 方法

2.1 芽孢杆菌的分离

将各样品80℃水浴热处理10min后，采用稀释涂布法进行芽孢杆菌菌株的分离。挑取性状差异明显的菌落，划线纯化、编号、保存、备用。

2.2 芽孢杆菌培养浓缩液制备

将各芽孢杆菌活化后，接入NB培养液，30℃、150 r/min下培养24 h后，将培养液按5%(v/v)的接种量接入装有150ml NB培养液的500ml的三角瓶，继续培养36 h得菌株培养液。4℃、12000 r/min下离心20 min取上清液，利用旋转蒸发仪40℃下进行10倍浓缩，得浓缩液。

2.3 病原菌菌悬液制备

将各病原菌活化后，接入NB培养液，37℃、150 r/min下摇床培养24 h得培养液，经无菌生理盐水稀释制得106cfu/ml的菌悬液。

2.4 抑菌试验

分别以3种病原菌为指示菌，采用牛津杯法(刘冬梅等，2006)进行芽孢杆菌对雏鸡细菌性腹泻病原菌的体外抑菌试验。取100μl病原菌菌悬液均匀涂布于NA培养基平板，无菌放置3只牛津杯于培养皿，吸取200μl芽孢杆菌培养浓缩液加入牛津杯中，将培养皿置于4℃冰箱扩散24 h，取出后37℃下恒温培养24 h，测量抑菌圈直径。每处理重复3次。

2.5 菌株鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等，2001)进行菌株的形态特征和生理生化特征鉴定，参照潘康成等(2010)的方法进行菌株的16S rDNA测序鉴定。

3 结果与分析

3.1 芽孢杆菌分离结果(见表1)

表1 芽孢杆菌菌株分离结果

如表1所示，从不同来源的3份样品中共分离得到芽孢杆菌菌株41株，分别编号、保存，进行体外抑菌试验。

3.2 抑菌试验结果(见表2)

表2 芽孢杆菌培养浓缩液对雏鸡细菌性腹泻病原菌的抑菌作用

以3种病原菌为指示菌，采用牛津杯法进行体外抑菌试验。结果显示，41株芽孢杆菌菌株中有6株对雏鸡细菌性腹泻病原菌均具有明显的体外抑菌作用，如表2所示。菌株D4和B332抑菌作用最佳，对其进行菌株鉴定。

3.3 菌株鉴定结果

3.3.1 菌株形态特征和生理生化特征

菌株D4细胞短杆状，G+，芽孢中生、卵圆形，在NA培养基平板上菌落圆形、白色、边缘裂叶状，表面起皱、不透明；菌株B332细胞短杆状，G+，芽孢中生、卵圆形，在NA培养基平板上菌落圆形、白色微黄，表面凸起粗糙、不透明。菌株D4和B332的生理生化特征与枯草芽孢杆菌标准株保持一致，过氧化氢酶、硝酸盐还原、淀粉水解、酪素水解、柠檬酸盐利用、V.P试验均为阳性，厌氧生长、吲哚实验、H2S产生均为阴性，可在含10%NaCl和pH值5.7的NA培养基上生长。

3.3.2 16S rDNA序列分析

利用NCBI的Blast程序进行菌株16S rDNA序列同源性分析，发现菌株D4的16S rDNA序列(FJ755786)与 Bacillus megaterium 108 (AB334764)、Bacillus megaterium An11-2(AB244448)的16S rDNA序列同源性达到100%，菌株B332的16S rDNA序列(HM136793) 与 Bacillus subtilis EA6-2 (JF496430)和BacillussubtilisWA3-4(JF496477)的序列同源性达到100%。

3.3.3 小结

综合菌株形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析，菌株D4和B332应分别归属于巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

4 讨论

芽孢杆菌是一类在自然界中广泛存在、好氧或兼性好氧、可形成芽孢的G+细菌，是国际公认的可在饲料中直接使用的微生物菌种。本试验以3种雏鸡细菌性腹泻病原菌为指示菌，采用牛津杯法进行体外抑菌试验，发现巨大芽孢杆菌D4和枯草芽孢杆菌B332对病原菌均具有明显的体外抑菌作用。

随着畜牧业的迅速发展和人民对食品安全的日益关注，微生态制剂以其绿色无污染、无残留等特点备受国内外广大研究者的青睐，其中在欧美和日本等国家以枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等为主的禽用微生态制剂已经广泛应用。而国内的研究相对落后，源于对动物本身肠道的益生微生物菌株的研究较少。巨大芽孢杆菌D4分离自海拔3000m以上高寒、无污染草原上生长的野牦牛牛粪，牛粪干物质主要是被瘤胃降解后的食料残余，混杂有大量的瘤胃共生微生物。由于野牦牛的生存环境几乎未受人类生产活动的影响，其瘤胃共生微生物的种群结构和物种组成可以认为完全是自然选择的结果(陈亮,2009)，为益生微生物菌株的筛选提供了新的来源。枯草芽孢杆菌B332分离自健康鸡的肠道内容物，根据宿主微生态特异性理论，本源肠道微生物将更易于在其肠道中定植和发挥作用，因此，由鸡肠道内正常菌群的分离得到对雏鸡细菌性腹泻病原菌具有明显的抑菌作用的芽孢杆菌为防治雏鸡细菌性腹泻病奠定了基础。作为微生态制剂的潜在生产菌株，菌株D4和B332的抑菌机理、产酶能力及其复合使用将有待于进一步研究。

若干篇，刊略，需者可函索）

（编辑：刘 占，laram ie_liu@yahoo.com）

S831.7

A

1001-991X（2011）18-0056-02

陈亮，河南工业大学生物工程学院，博士，450001，河南郑州市高新区莲花街。

黄亮、李静琴，单位及通讯地址同第一作者。

2011-07-04

河南省重点科技攻关项目[112102110018]；河南工业大学引进人才专项基金资助项目[2009BS052]；河南工业大学科研基金招标项目[10XZP004]