配位对二氢杨梅素晶体结构与抗氧化活性的影响

俞思明，朱思明*，于淑娟，林景聪，许 敏

(华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640)

配位对二氢杨梅素晶体结构与抗氧化活性的影响

俞思明，朱思明*，于淑娟，林景聪，许 敏

(华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640)

食用植物有效成分的非晶化配位可能会产生新的或更好的药物活性。本实验研究二氢杨梅素(DMY)与Cu配位的优化工艺条件、配位前后DMY的晶体结构和抗氧化活性的变化。结果表明：DMY与Cu配合的最佳工艺条件为40℃、反应时间60min、pH 9.5；配位后DMY的UV-Vis光谱最大吸收峰由292nm红移至332nm；经理论化学计算和FT-IR光谱证实，DMY的4位羰基和5位羟基O原子参与配位；配合物对羟自由基(·OH)的清除能力提高，这可能和配位后DMY出现的非晶化现象有关。

二氢杨梅素(DMY)；Cu；配合物；抗氧化

食用植物有效成分配位后可能产生新的或更好的药物活性，中药配合物新药是中药新药研制的新方向[1]。据文献报道，某些食用植物有效成分的非晶化往往会提高其生物活性[2]。二氢杨梅素(3,5,7,3＇,4＇,5＇-六羟基2,3-双氢黄酮醇，dihydromyricetin，DMY)，又称蛇葡萄素，双氢杨梅素，是一类双氢黄酮醇类化合物[3]。其结构式见图l。在显齿蛇葡萄属植物中(如藤茶，主要分布于长江流域以南的广东、广西等地)其含量高达20%[4]。有关研究表明DMY具有清除氧自由基，防止油脂食品氧化变质及消炎、抑菌、降脂、抗肿瘤等生理活性[5-6]。有学者认为二氢杨梅素可以螯合金属离子并且螯合作用发生在3-羟基-4-羰基上或3',4'酚羟基上，从而消除金属离子对自由基氧化的催化作用[7-8]。国内外对DMY与铁、锌离子的螯合产物的研究已经很多。但是，有关DMY与Cu螯合产物的晶体结构、抗氧化性变化及两者之间关系的研究报道还较少，缺乏系统性的研究。

本实验探讨人体必需微量元素Cu与DMY的配合的最佳工艺条件，以及配位前后DMY抗氧化活性的变化和晶体结构变化，以期改善配体DMY的生物活性或发现新的生物活性，寻找DMY配位后反应活性变化的非晶化根据。

图1 二氢杨梅素的化学结构Fig.1 Chemical structure of dihydromyricetin (DMY)

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

二氢杨梅素 参考文献[9]自制；无水乙醇 天津市凯通化学试剂有限公司；碳酸钠、氯化铜 天津市科茂化学试剂有限公司。

S11-2恒温水浴锅 上海跃进医疗器械厂；LDA-2A真空干燥箱 上海一恒科技有限公司；TU-1810 型紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；FT-IR-650傅里叶红外光谱仪 天津港东科技发展股份有限公司；D8 ADVANCE XRD仪 德国Bruker公司。

1.2 方法

1.2.1 DMY-Cu配合物合成的单因素试验

1.2.1.1 反应pH值的确定

DMY在碱性条件下易与金属离子发生配合反应产生沉淀，但其在强碱作用下会发生彻底的不可逆解环[10]，因此仅考察pH值范围8.0～10.0。将1.0×10-3mol/L的DMY乙醇溶液与等物质的量浓度等体积的CuCl2-乙醇溶液在带三口烧瓶(带搅拌和冷凝)中，在反应温度40℃和反应时间60min条件下进行试验，探讨pH值对配合反应的影响。反应液中会产生配合物的沉淀，根据离心分离后上清液的OD332nm(332nm是DMY-Cu配合物的特征吸收波长)大小确定最佳反应pH值。上清液于紫外-可见分光光度计中测定其OD332nm值，以其OD332nm值间接反映产率的大小(上清液的OD332nm反应结晶母液中残留配合物浓度，由于DMY和Cu的配比完全一致，则OD332nm越大，反应溶液中残留配合物越多，产率越低，下同)。

1.2.1.2 反应时间的确定

试验方法同上。选取反应时间15、30、45、60min和75min，反应pH 9.5，反应温度40℃的条件下进行试验，根据离心分离后上清液的OD332nm大小确定最佳反应时间。

1.2.1.3 反应温度的确定

试验方法同上。选取反应温度40、50、60℃和70℃，在pH9.5，反应时间60min的条件下进行试验，根据离心分离后上清液的OD332nm大小确定最佳反应温度。

1.2.2 二氢杨梅素Cu配合物的制备

在带有搅拌器、干燥管、冷凝管的三口烧瓶中加入0.02mol/L 的DMY的无水乙醇溶液，加入等物质的量的CuCl2的无水乙醇溶液，用5g/100mL的NaOH-乙醇溶液调节pH9.5，于40℃下反应回流lh，产生浅褐色沉淀。反应液冷却至室温后在4000r/min离心10min，分离上清液。沉淀先用乙醇洗涤，再用水洗数次，固体产物在40℃真空干燥箱中干燥即可。

1.2.3 量子化学计算[11]

运用Hyperchem 软件对DMY分子进行结构优化，并进行半经验的全略微分重叠(CNDO/2)计算，根据分子中各O原子所带电荷对DMY分子可能配位位点进行预测。

1.2.4 DMY及DMY-Cu对羟自由基的清除作用测定

在25mL比色管中依次加入3mL 2mmol/L Fe3O4、3mL 1mmol/L H2O2溶液，摇匀，再加入3mL 6mmol/L 水杨酸，摇匀，于37℃水浴加热15min后取出，测其吸光度A0。另取25mL 比色管依次加入3mL 2mmol/L FeSO4、3mL 1mmol/L H2O2溶液，摇匀，分别加入1.5×10-2mol/L待测液0.0、1.0、2.0、3.0mL，于37℃水浴中加热15min后取出，然后再加入6mmol/L 水杨酸溶液3mL，继续水浴加热15min，取出用蒸馏水补充至25mL，摇匀，测其吸光度Ai[12]。

1.2.5 DMY及其Cu配合物的光谱分析和XRD分析

配制DMY及DMY-Cu的乙醇溶液并在200～600nm波长处测定其紫外吸收光谱。取约1mgDMY及其Cu配合物分别与约100mg的KBr在玛瑙研钵中研磨混合均匀，分别取少许上述混合物倒入压片模中，用压片器压制成透明薄片，进行红外光谱分析。在相同条件下使用X 射线衍射仪对DMY及其Cu配合物进行分析。实验条件：Cu靶，40kV，40mA，步长0.02°，扫描速度17.7s/步。

2 结果与分析

2.1 不同工艺条件对配合反应的影响

2.1.1 pH值对配合反应的影响

图2 pH值对配合反应的影响Fig.2 Effect of pH on coordination reaction

由图2可知，pH值对配合反应的影响较大，pH值在8.0～9.0间变化，上清液的OD332nm值急剧下降，说明在碱性条件下有利于配合反应进行，DMY-Cu配合物产率升高；pH 9.5时OD332nm值达到最小，产率达到最大；但当pH值超过9.5时上清液的OD332nm值又开始上升，分析其原因可能是由于pH值过高，DMY的分子结构遭到破坏，配合反应不能顺利进行导致产率下降。

2.1.2 温度对配合反应的影响

图3 温度对配合反应的影响Fig.3 Effect of temperature on coordination reaction

由图3可知，反应温度为40℃，温度升高配合反应正向进行，产率增加；反应温度在40～60℃范围内时，转化率虽增加，但配合物溶解度增加，沉淀量下降，产量下降，这可同任志秋等[13]的结果相验证；反应温度达到70℃后，高温下配合物可能不稳定，变成其他物质，产率下降。

2.1.3 时间对配合反应的影响

图4 时间对配合反应的影响Fig.4 Effect of time on coordination reaction

由图4可知，在15～60min的反应时间范围内，随着反应时间的增加，上清液的OD332nm值逐渐减小，在60min时达到最小值，此时产率达到最大；随着反应时间的进一步增加，上清液的OD332nm值略有增加，产率逐渐降低，分析其原因可能是随着反应时间的延长，出现一定程度的逆反应。

2.2 DMY及其Cu配合物的紫外-可见光谱分析

图5 DMY及DMY-Cu的紫外可见光谱图Fig.5 UV-visible spectra of DMY and DMY-Cu complex

由图5可知，DMY在292nm波长处有最大吸收，与Cu配位后，其在332nm波长处出现最大吸收，特征吸收峰发生40nm红移现象，说明有DMY-Cu配合产物的生成。

2.3 DMY及其Cu配合物的红外光谱分析

图6 DMY及DMY-Cu配合物的红外光谱Fig.6 FT infrared spectra of DMY and DMY-Cu complex

由图6可知，DMY-Cu配合物在3300～3500cm-1处有强吸收峰，这是O-H的特征峰，说明配合物中酚羟基的存在，但吸收峰的宽度没有DMY宽，说明DMY-Cu配合物中酚羟基数可能比DMY中少；DMY-Cu配合物在1467cm-1处仍存在强吸收峰，在芳环骨架振动C＝C频率区1450～1600cm-1内，说明DMY-Cu苯环结构还存在；分子中C-O-C键的振动频率(1050～1250cm-1)基本未变，表明DMY的C环醚键在选用配位条件下未发生开环；DMY在1644cm-1处有强吸收峰，这是4位羰基产生的强吸收峰，DMY和Cu形成DMY-Cu后，由于金属的配合作用，降低了4位羰基上碳氧原子的电子云密度，使碳氧双键减弱，吸收峰的位置移至1626cm-1处。同时，在指纹区601cm-1处出现新的强吸收峰，这是M-O键的吸收峰，说明确实有DMY-Cu配合物的生成。

2.4 DMY配位位点的量子化学计算分析

图7 计算后DMY分子的化学结构Fig.7 Chemical structure of DMY after theoretical quantum chemistry calculation

由图7可知，4位羰基O原子所带电荷为-0.319(相对电荷，相当于一个电子所带电荷的0.319倍，下同)，在8个O原子的电荷值中最大，故预测DMY分子中4位羰基O原子肯定参与了配位，这可从2.3节的红外光谱分析中得到验证。另外，3位羟基和5位羟基O原子电荷值分别为-0.291和-0.278，明显大于其他O原子电荷值，故3位和5位羟基O原子是可能的配位位点。据文献[10]和[14]报道，DMY能以4位羰基和5位羟基与Zn和Cu配位，DMY与Cu配位的物质的量比为1:1，以4位羰基和5位羟基与Cu配位, 这与A环和4位羰基的π-π共轭有关。

2.5 DMY及DMY-Cu的XRD分析

图8 DMY及其Cu配合物的衍射图谱Fig.8 XRD spectra of DMY and DMY-Cu complex

由图8可知，DMY在2θ为11.376°、14.589°和22.948°处有强衍射峰，而DMY-Cu的特征衍射峰出现在2θ为28.982°、33.787°处，而DMY在此处却无衍射峰，说明DMY与Cu发生了配位反应。而且，DMY和Cu配位后，出现弥散衍射特征，而DMY的XRD图中仅有尖峰衍射特征，说明DMY与Cu配位后出现非晶化现象[15]。

2.6 DMY及DMY-Cu对羟自由基的清除作用测定

图9 DMY及DMY-Cu配合物对·OH的清除率Fig.9 Scavenging rates of DMY and DMY-Cu against hydroxyl free radicals

由图9可知，DMY及DMY-Cu对·OH有很好的清除效果，且清除效果随浓度的增大而增大。当浓度在1.5×10-2mol/L时，两者的清除率是一样的，但当浓度大于1.5×10-2mol/L时，DMY-Cu的清除效果优于DMY。分析其原因可能是DMY-Cu配合物有类似超氧化物歧化酶(SOD)的活性，并消除了金属离子对自由基氧化的催化作用；另外，DMY与Cu配位后的非晶化现象也是可能的原因。

3 结 论

3.1 通过单因素试验确定DMY-Cu配合反应的最佳工艺条件是温度40℃、pH9.5、反应时间为60min。

3.2 UV-Vis、XRD、FT-IR和理论量子化学计算分析结果表明，DMY的5位羟基和4位羰基与Cu发生非晶化配位。在实验条件下，DMY的C环没有开环，还有部分羟基未参与配位。

3.3 实验证明DMY-Cu配合物对·OH具有很好的清除能力，且清除效果明显优于DMY，即与DMY-Cu配合物的抗氧化能力优于DMY。这可能DMY配位后的非晶化以及DMY-Cu有类似超氧化物歧化酶活性有关。

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Effect of Coordination on Crystal Structure and Antioxidant Activity of Dihydromyricetin

YU Si-ming，ZHU Si-ming*，YU Shu-juan，LIN Jing-cong，XU Min
(College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

Non-crystallization coordination of bioactive ingredients in edible plants can generate new or better pharmacological activity. In this paper, the optimal reaction conditions between dihydromyricetin (DMY) and Cu2+, the effect of coordination on the crystal structure and antioxidant activity of DMY were investigated. Results indicated that the optimal reaction conditions were reaction temperature of 40 ℃, reaction time of 60 min and reaction pH of 9.5. The characteristic absorption peaks were 332 nm for DMY-Cu complex and 292 nm for DMY, which may be ascribed to the oxygen from 4 carbonyl and 5 hydroxyl groups participated in coordination according to FT-IR analysis and theoretical chemical calculation of DMY or its complex. In addition, the scavenging capability of DMY against hydroxyl free radicals (·OH) was increased due to the non-crystallization coordination according to XRD analysis of DMY and its complex.

DMY；Cu；complex；antioxidation

O623.54

A

1002-6630(2011)07-0034-04

2010-05-26

广东省科技计划项目 (2008A080403009)；2008—2009年度学生研究计划(SRP)项目(Y1090070)

俞思明(1985—)，男，硕士研究生，主要从事制糖工程研究。E-mail：tayiya@126.com

*通信作者：朱思明(1976—)，男，讲师，博士，主要从事植物有效成分的资源利用和化学改性研究。

E-mail：lfsmzhu@scut.edu.cn