生物芯片技术在肿瘤研究中的应用*

张 战,朱 波综述,林治华△审校

(1.重庆理工大学药学与生物工程学院 400054;2.第三军医大学新桥医院全军肿瘤研究所,重庆 400037)

生物芯片技术在肿瘤研究中的应用*

张 战1,朱 波2综述,林治华1△审校

(1.重庆理工大学药学与生物工程学院 400054;2.第三军医大学新桥医院全军肿瘤研究所,重庆 400037)

蛋白质阵列分析;寡核苷酸序列分析;组织芯片;生物芯片

恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康的多发病和常见病。根据世界卫生组织2003年公布的数据,2000年全球共有恶性肿瘤患者1 000万,其中男530万,女470万,因恶性肿瘤死亡者高达620万,占总死亡人数的12%,在多数发达国家可达25%,在居民死亡原因中居第1位。如果这一趋势得不到改善,预期到2020年,全球每年新发病例将达 1 500万[1]。面对这一严峻的局面,全球早已联合行动抗击恶性肿瘤。从恶性肿瘤临床诊断、治疗的历史和现状分析可见,科学技术革命对肿瘤治疗进展起着重要作用。

生物芯片(biochip)技术是生命科学与微电子等学科相互交叉发展起来的一门高新技术,是随着人类基因组计划(human genomic project,HGP)的研究发展应运而生的。20世纪90年代初,美国斯坦福大学的学者提出芯片的概念并进行序列的研究,到1996年底,第1块生物芯片问世。生物芯片主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统,以实现对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。生物芯片技术的发展迅速,并且在基因表达、基因突变及多态性分析、疾病诊断、药物筛选、序列分析等领域已显示出重要的理论和实际应用价值。生物芯片技术作为电子学和生命科学结合产生的高科技杰作,虽然诞生仅仅几年的时间,却引起人们的广泛关注,它将给传统医学带来一场新的革命。从最早开始研究至今,生物芯片已广泛应用于基因表达的筛选、特异性抗原抗体的检测、蛋白质相互作用的研究、新药的研制开发、疾病研究等多个领域,尤其在临床医学方面,对某些疾病特别是肿瘤及遗传性疾病的相关蛋白识别上取得了一系列突破性进展。常用的生物芯片分为3类,即基因芯片、蛋白质芯片和组织芯片。本文主要就其在肿瘤研究中的应用作一简要综述。

1 生物芯片的概念及分类

1.1 基本概念 生物芯片由美国Affymetrix公司首先开发,在短短数年中生物芯片技术进步迅速,并呈现发现高峰。所谓生物芯片是由固定于不同种类支持介质上的高密度寡核苷酸分子、基因片段或多肽分子的微阵列组成,其中每个分子的位置及序列为已知,当荧光标记的靶分子与芯片上的探针分子结合后,可通过激光共聚焦荧光扫描或电荷耦联摄影像机(CCD)对荧光信号强弱的检测而判断样本中的靶分子数量,以实现对化合物、核酸、蛋白质、细胞及其他生物组分的准确、快速和大信息量的筛检,其特点是高度平行性、多样性、微型化和自动化[2]。

1.2 生物芯片的制备 制备生物芯片的固相介质有玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、硝酸纤维素膜、尼龙膜等。目前较为常用的是玻片。按照生物芯片上使用探针的不同,生物芯片分为基因芯片和蛋白质芯片。基因芯片是把寡核苷酸或靶DNA作为探针,可以对大量不同靶DNA进行分析,也可以对同一靶DNA进行不同探针序列的分析。基因芯片又称为DNA芯片、DNA阵列。按芯片上探针的不同,生物芯片可分为基因芯片和蛋白质(肽)芯片。如果芯片上固定的分子是寡核苷酸探针或靶DNA,则称为基因芯片;如果芯片上固定的是肽或蛋白质,则称为蛋白质芯片或肽芯片。在合成探针之前要在支持物表面键合上各种各样的活性基因,如羟基或氨基,以便与配基共价结合形成具有不同生物特异性的亲和载体,用来固定各种不同的活性生物探针,如蛋白质、核酸、酶、多肽、抗原、抗体等。1.3 生物芯片的分类 目前生物芯片主要包括基因芯片、蛋白芯片及组织芯片3类[3-4]。基因芯片作为目前研究最多的一种生物芯片,是利用核酸杂交原理检测未知分子,基因芯片是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针,有规律地排列固定于支持物上,然后与待测标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交,再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描,并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号进行比较和检测,从而迅速得出所要的信息。蛋白质芯片也叫蛋白质微阵列(protein microarray),它和基因芯片一样,同属于生物芯片的范畴,一般包括固相载体、芯片表面介质及芯片的检测设备3个基本组成部分[5]。组织芯片是由美国科学家 Kononen等[6]首次提出的。它是指将数十个、数百个乃至上千个小的临床组织标本按预先设计的顺序整齐地排列在某一载体上(通常是玻片)而成的微缩组织切片,是一种高通量、多样本的分析工具。这样就使科研人员一次有可能同时对几百种其至上千种正常或疾病组织样本,以及疾病发展不同阶段的自然病理生理状态下的组织样本进行某一个或多个特定的基因及与其相关的表达产物的研究。

2 生物芯片在肿瘤治疗中的应用

2.1 基因芯片在肿瘤治疗中的应用 基因芯片应用面很广,其应用主要概括为质和量的检测[7]。质的检测:包括DNA测序及再测序、基因突变和单核苷酸多态性(SNP)检测等,主要用寡核苷酸芯片完成;量的检测:包括检测mRNA水平、病原体的有无及比较基因组中基因的拷贝数等,量的检测既可用寡核苷酸芯片,又可用 DNA文库(cDNA)芯片完成,但cDNA芯片更具优势。由于DNA芯片可以同时对多个基因进行检测和分析,并且可以直接检测mRNA的种类及丰富度,因此它是研究基因表达的一种强有力的工具。

Alon等[8]用代表6 500个基因的寡核苷酸芯片研究结肠癌基因表达谱,并且通过表达谱数据对基因和组织进行聚类分析,广泛提示了基因表达图谱的相关性。通过这种方法,可将基因分成功能群,用于疾病发生及临床诊断等方面研究。Maqani等[9]通过分子切割对上消化道腺癌17q12扩增子的研究发现,UGCs区的PPP1R1B/DA RPP-32和GRB7与转录活性的瘤原性区域相关。有学者发现N-甲基天冬氨酸受体2B(NMDAR2B)在人类食管癌可以抑制肿瘤活性。NMDAR2B受体甲基化在食管癌中可终止基因转录并能抑制细胞凋亡。Imazawa等[10]鉴定 Ca2+凝结蛋白 S100A2是 p53同系物deltaNp63新发现的下游调节蛋白,其过表达在食管鳞状上皮细胞癌中经常被观察到,可能与食管癌的发生、发展相关。Pollack等[11]分别用 Cy 5和Cy 3标记来自乳腺癌和卵巢癌患者及健康者细胞的DNA样品,然后与来自乳腺癌和卵巢癌患者及健康者细胞的cDNA构成的微阵列杂交,分析了与乳腺癌和卵巢癌的发展有关的基因。

2.2 蛋白质芯片在肿瘤治疗中的应用 Banez等[12]通过Ciphergen公司的蛋白质芯片系统产生正常血清内的蛋白质谱,随后使用该公司的生物标志模式软件分析。在他们的研究中,106例前列腺癌患者和56位健康者被随机分为推算组(44例患者和30位健康者组成,用于建立决定树算法)和检测组(62例患者和26位健康者组成,用于决定树算法的检验),结果表明,联合弱阳离子芯片和铜离子芯片所得质谱资料建立的算法用于前列腺癌,其敏感性和特异性均为85%。该研究认为两种芯片的联合应用可以大大提高蛋白质芯片技术的检测效力。据Petricoin等[13]报道,用疏水性C16芯片对50例对照组(卵巢囊肿13例,健康者37位)和50例卵巢癌(Ⅰ期6例,Ⅱ～Ⅳ期44例)患者血清进行质谱分析,结果发现在质/荷比值为534、989、2 111、2 251和2 465处的5个峰的同时变化,对于诊断具有重要意义。Li等[14]将192例血清标本(乳腺癌组126例,其中 T0期4例、T1期 38例、T2期 37例、T3期 24 例、T4期23例;非癌组包括41位健康女性和25例良性乳腺疾病患者)点样在金属螯合芯片上,然后用PBS-Ⅱ型阅读仪读片,并用专用生物标志物模式软件分析结果。通过研究3个蛋白质的组合可以较理想地将早期乳癌组(T0、T1)和非癌组鉴别开来。交叉验证敏感性为93%、特异性为91%。显示了其用于乳腺癌早期检测的巨大潜力。

2.3 组织芯片在肿瘤治疗中的作用 师建国等[15]用胃癌组织芯片研究了抗凋亡蛋白BAG21在胃癌中的表达,发现在胃癌组织中,BAG21的表达率显著高于正常胃黏膜组织及胃癌旁增生组织(P＜0.01)。在不同分化程度的胃癌组织中BAG21的表达率差异无统计学意义(P＞0.05)。可见BAG21的表达只是胃癌发生的早期分子事件,故可作为胃组织发生癌变的早期诊断指标。Al-Taie等[16]在结肠癌中发现存在硒蛋白p基因突变和转录异常,提示硒蛋白p基因是人体的一种保护性因子。黏液素的表达与多种肿瘤的预后有关,在用于估计胃癌预后时,各种文献报道不一。Zhang和Zhang[17]为了比较Maspin蛋白在不同肿瘤组织中表达与其功能情况,构建了一个含有400例(包括8种肿瘤)肿瘤组织和22份正常组织的芯片。通过免疫组化技术检测发现Maspin蛋白存在于大多数正常组织中,但在其相应的恶性组织中,含量普遍下降。另外,他们还通过针对p5～53蛋白与Maspin蛋白进行双标记染色,结果发现突变的p53蛋白与Maspin蛋白的含量之间呈负相关,从而推测Maspin蛋白的表达与p53蛋白相关。

3 问题及展望

近年来生物芯片的进展迅速,并且也展示了其独特的优越性,但仍面临一些问题有待解决。目前面临的主要问题:(1)技术成本高,需一系列昂贵的尖端仪器,如光刻机器和寡核苷酸合成仪,激光共聚焦显微镜等设备;(2)现在通常采用荧光标记待测物技术检测信号,而荧光检测信噪比较低,检测灵敏度有限;(3)由于在固相上杂交,探针的合成与固定比较复杂,特别对于制作高密度的探针阵列,并且在同一个芯片上存在多种探针,一种探针杂交最适条件未必适于另一种探针,复杂的探针易自身形成二、三级结构,从而影响杂交,出现错误的阴性信号。基因芯片在医学上的应用前景无疑是非常广阔的,但要成为实验室或临床可以普遍采用的技术仍有一些关键问题需要解决:(1)现阶段芯片检测的灵敏度决定了需要首先扩增模板,一般采用PCR方法,不可避免地会受到PCR所具有的局限性的影响;(2)目前采用的荧光标记方法存在检出灵敏度低的问题;(3)芯片杂交的条件高度个体化,难以形成比较统一、规范的杂交环境,给应用带来障碍。虽然蛋白质芯片已经在生命科学研究领域取得了一系列令人可喜的成果,但相对于基因芯片的进展速度,它的研究进展显得相对滞后,主要有以下问题亟待解决:用于点制芯片表面蛋白质的制备和纯化问题;固相载体材料表面的修饰方法;试验的标准化、数据报告的规范化;大量数据的处理、分析软件的开发;高度集成化样品制备及检测仪器的研制和开发。组织芯片的发展也还存在着一些急需解决的问题:(1)与组织芯片应用相配套的读片系统、信息处理系统还不够完善,现在基本上还是人工处理,但是由于组织芯片小,样本数量多,人工观察和分析的难度较大,且分析所得结果也存在一定的个体差异;(2)组织芯片的制备、染色和检测方法还有待探索,如样本的大小、组织的准确定位、假阳性的剔除等。随着国内外学者的共同努力,生物芯片技术的一些缺陷将得到改善,并且其商业化、产业化速度也将大大加快,生物芯片在其他领域的潜力也会被更好地发掘出来,为今后的研究工作带来极大方便,总之,生物芯片将对人类生活产生极其广泛、深远的影响。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2011.05.037

A

1671-8348(2011)05-0493-03

国家自然科学基金资助项目(30571714,60873103,30830090)。△< class="emphasis_bold">通讯作者,

,Tel:(023)68668121;E-mail:zhlin@cqut.edu.cn。

2010-09-02

2010-11-09)

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