超临界CO2萃取工艺条件对栀子油脂肪酸组成及其抗氧化活性的影响

包亚妮，董建青，袁 芳

(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

超临界CO2萃取工艺条件对栀子油脂肪酸组成及其抗氧化活性的影响

包亚妮，董建青，袁 芳*

(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

利用气相色谱(GC)测定栀子油脂肪酸组成。结果显示栀子油中主要含有5种脂肪酸，即亚油酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸和亚麻酸。在萃取压力30MPa、温度55℃、CO2流速15kg/h条件下分别占44.38%、24.96%、24.83%、2.55%、1.31%。萃取压力、温度、CO2流速对其脂肪酸组成具有一定的影响，但不显著。通过清除DPPH和ABTS自由基，得出栀子油具有一定的抗氧化活性。不同萃取压力、温度、CO2流速对栀子油清除DPPH和ABTS自由基的能力具有不同程度的影响。

栀子油；超临界CO2；脂肪酸组成；抗氧化性

栀子为茜草科植物栀子(Gardenia jasminoides Ellis)的干燥成熟果实。据《本草纲目》等记载，栀子性寒味苦，无毒，具有泻火解毒、清热利湿、凉血散淤等作用[1]。目前，关于栀子中的色素[2-3]、黄酮类[4-5]、栀子甙[6-7]等方面的研究报道较多，而关于栀子油的研究却较为少见。

不饱和脂肪酸是人体必需的脂肪酸，具有能降低血液中的胆固醇和甘油三酯含量，增强细胞膜通透性，阻止心肌组织和动脉硬化，改善血液微循环，提高脑细胞活性等功能[8]。栀子油中含有较多的不饱和脂肪酸，研究超临界CO2工艺条件对栀子油脂肪酸组成及含量的影响还未见报道，故本研究能为更有效地利用栀子资源提供一定的理论依据和参考。

随着人们生活水平的提高，消费者对食品的生理保健作用越来越重视，特别是食品的抗氧化功能。抗氧化物质可以抵御自由基对人体的侵害，缓解由自由基引起的一系列疾病，例如动脉硬化、心血管疾病、癌症、机体老化等[9]。因此，评价栀子油是否具有强的抗氧化活性是研究的必然趋势。目前，还未见对栀子油抗氧化性的研究报道。本实验对栀子油清除自由基能力进行研究，为栀子油的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

栀子油(以干燥水栀子全果为初始原料，由超临界C O2萃取得到)；氯仿、正庚烷、正己烷、三氟化硼乙醚溶液、氢氧化钾、过硫酸钾(均为分析纯) 北京化学试剂有限公司；DPPH、ABTS、水溶性VE、α-生育酚 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

华黎超临界流体萃取装置 杭州华黎泵业有限公司；AR114分析天平 上海奥豪斯国际贸易有限公司；电热恒温水浴锅 北京长风仪器仪表有限公司；6890N气相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司；UV-1800型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；漩涡混合器 北京金北德工贸有限公司；SENCO R系列旋转蒸发仪 上海申生科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超临界CO2萃取

通过预试验确定二级分离条件为：分离Ⅰ温度40℃，压力6.5MPa；分离Ⅱ温度为室温(30～35℃)，压力5.8MPa。对可能影响萃取效果的因素——萃取压力、萃取温度和CO2流速进行单因素试验，探讨其对栀子油脂肪酸组成和抗氧化性的影响。单因素条件为萃取压力15、22.5、30、37.5、45MPa，萃取温度35、45、55、65、75℃，CO2流速5、10、15、20kg/h。

1.3.2 脂肪酸组成及含量分析

1.3.2.1 脂肪酸甲酯化

采用GB/T 17376—1998《动植物油脂：脂肪酸甲酯制备》方法[10]，取栀子油样品约0.1g置于50mL磨口三角瓶中，加入6mL 0.5mol/L氢氧化钾-甲醇溶液，摇匀后接入冷凝管，在80℃水浴中加热并使溶液沸腾1h，再从直型冷凝管上口向瓶中加入7mL 15% BF3-甲醇溶液，反应2min后，再加入6mL正庚烷，继续反应1min后，取出三角瓶，冷却后立即加入饱和氯化钠溶液至正庚烷液面接近三角瓶口，最后吸取上清液经微孔滤膜(0.45μm)过滤，按预实验确定的条件进行气相色谱分析，取3次测定平均值。

1.3.2.2 气相色谱分析条件

色谱柱：HP-Innowax(30m×0.32mm，0.25mm)；载气：N2，1mL/min恒流；进样口温度250℃，分流比：1:20；进样量：1μL；FID检测器温度：250℃；尾吹气：N2，40mL/min；空气流速：450mL/min；氢气流速：45mL/min。程序升温：初始170℃，保持14min，以10℃/min速度升温至230℃，保持10min。

1.3.3 抗氧化活性分析

1.3.3.1 清除DPPH自由基能力的测定

在Shyu等[11]方法的基础上加以改进，用氯仿配制0.1mmol/L D PPH溶液，向一系列的试管中加入3mL DPPH溶液，分别加入不同浓度的α-生育酚溶液或者0.04g/mL油样品溶液1mL，空白组加入同体积的氯仿，振荡20s后室温避光隔氧放置30min，在517nm处测定吸光度，并计算自由基清除率。

式中：A0为DPPH空白对照的吸光度；A为30min后样品与DPPH反应后的吸光度；B为样品空白的吸光度。栀子油样品的DPPH自由基清除能力与α-生育酚清除DPPH自由基能力相对比，确定其相对抗氧化性，以α-生育酚抗氧化当量表示，即每100g待测栀子油的自由基清除能力相当于α-生育酚对自由基清除的毫克数。

1.3.3.2 清除ABTS自由基能力的测定

采用Roberta等[12]的方法进行改良，称取17mg过硫酸钾加26mL水得过硫酸钾溶液，取上述过硫酸钾溶液2.6mL，加入10mg ABTS，配制成ABTS母液，暗处放置12～16h后，取上述母液0.8mL，用甲醇定容至50mL，制得ABTS溶液备用。向一系列试管中加3mL ABTS溶液，分别加入不同浓度的水溶性VE溶液或者用甲苯-甲醇(1:1)定容制得的0.01g/mL油样品溶液1mL，空白组加入同体积的甲苯-甲醇(1:1)溶液，振荡20s后室温避光隔氧放置40min，在734nm处测定吸光度，计算ABTS自由基清除率。

式中：A0为ABTS空白对照的吸光度；A为40min后样品与ABTS反应后的吸光度，栀子油样品的ABTS自由基清除能力与水溶性VE清除ABTS自由基能力相对比，确定其相对抗氧化性，以水溶性VE抗氧化当量表示，即每100g待测栀子油的自由基清除能力相当于水溶性VE对自由基清除的微摩尔数。

2 结果与分析

2.1 不同萃取工艺条件对栀子油脂肪酸组成的影响

2.1.1 栀子油脂肪酸组成分析

本实验采用气相色谱(GC)对甲酯化的栀子油脂肪酸成分进行定性分析，栀子油的气相色谱图见图1。通过与标准品的比对，并采用峰面积归一化法，确定各脂肪酸组分在总脂肪酸中的百分含量，标准品的脂肪酸气相色谱图如图2所示。由图1经分析可得，栀子油含有的脂肪酸种类相对较少，主要为亚油酸(C18:2)、油酸(C18:1)、棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)和亚麻酸(C18:3n3)5种。在萃取压力30MPa、温度55℃、CO2流速15kg/h条件分别占44.38%、24.96%、24.83%、2.55%、1.31%(平均值)。经GC分析得，栀子油中还含有花生酸、顺-11-二十碳烯酸、顺-11,14-二十碳二烯酸、顺-11,14,17-二十碳三烯酸和顺-8,11,14-二十碳三烯酸，但含量都十分稀少，均少于1%。

图1 栀子油脂肪酸气相色谱图Fig.1 Gas chromatogram of fatty acids in gardenia oil

图2 标准品脂肪酸气相色谱图Fig.2 Gas chromatogram of fatty acid standards

2.1.2 萃取压力、温度和CO2流速对栀子油脂肪酸组成的影响

图3 萃取压力对栀子油脂肪酸组成的影响Fig.3 Effect of extraction pressure on the fatty acid composition of gardenia oil

图3～5分别是在55℃、CO2流速15kg/h条件下不同压力和30MPa、CO2流速为15kg/h条件下不同温度以及55℃、30MPa条件下不同CO2流速均经过120min萃取后得到的栀子油的脂肪酸组成。

由图3可知，不同萃取压力对栀子油中各种脂肪酸含量的影响较小，其中含量最多的亚油酸仅在42.5%～44.4%之间做微小的波动，而其他脂肪酸的波动范围则更小，差异不显著(P＞0.05)。但值得注意的是，如表1所示，相比于其他压力条件，30MPa压力条件下萃取所得的栀子油中不饱和脂肪酸的总含量为最高。

表1 不同萃取压力条件下栀子油中总不饱和脂肪酸含量Table1 Total unsaturated fatty acid contents in gardenia oils extracted under different extraction pressures

图4 萃取温度对栀子油脂肪酸组成的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the fatty acid composition of gardenia oil

由图4可知，不同萃取温度对栀子油中各种脂肪酸含量的变化趋势与萃取压力对其的影响较为相似，差异亦不显著，这与徐响在研究超临界CO2萃取沙棘全果油时得出的结论相一致[13]。从图4亦可明显看出，油酸与棕榈酸两条曲线几乎重合，且变化趋势一致。硬脂酸及亚麻酸的含量更是几乎无明显变化。同样地，由表2可知，相对其他温度条件，55℃萃取所得的不饱和脂肪酸总含量最多。

表2 不同萃取温度条件下栀子油中总不饱和脂肪酸含量Table2 Total unsaturated fatty acid contents in gardenia oils extracted under different extraction temperatures

由图5可知，相对于萃取压力和温度，CO2流速对栀子油中脂肪酸组成的影响略为明显。其中含量较高的亚油酸、油酸和棕榈酸的波动趋势均为先降低后升高再降低，且均在流速为5kg/h时已达到最大值，故流速的增加并不能提高此3种脂肪酸的萃取率。对于含量较低的亚麻酸，其整体波动较小，但变化趋势则恰好相反，表现为先升高后降低再升高的趋势，且在5kg/h时的含量最低，仅为最大值的58%。

图5 CO2流速对栀子油脂肪酸组成的影响Fig.5 Effect of CO2flow rate on the fatty acid composition of gardenia oil

2.1.3 超临界CO2与索氏萃取的栀子油脂肪酸含量的比较

选取条件为30MPa、55℃、15kg/h的超临界CO2萃取与正己烷索氏提取的栀子油脂肪酸含量进行比较，见表3。由表可知，两种萃取方法对栀子油脂肪酸含量的影响差异不显著。栀子油主要含不饱和脂肪酸，其中多不饱和脂肪酸约45%，单不饱和脂肪酸约24%，饱和脂肪酸约27.5%。超临界CO2萃取的栀子油不饱和脂肪酸含量较正己烷索氏提取的略高一些。这可能是因为超临界CO2的萃取条件较温和，对栀子油功效成分的保留效果较好。

2.2 不同萃取条件对栀子油清除自由基能力的影响

2.2.1 标准曲线的建立

将栀子油样品的DPPH及ABTS自由基清除能力分别与α-生育酚和水溶性维生素E清除自由基能力相对比，本实验采用α-生育酚和水溶性VE抗氧化当量表示栀子油抗氧化能力的大小，标准曲线见图6、7。

图6 α-生育酚-DPPH自由基清除率标准曲线Fig.6 Standard curve of scavenging effect ofα-tocopherol on DPPH radicals

图7 水溶性VE-ABTS自由基清除率标准曲线Fig.7 Standard curve of scavenging effect of Trolox on ABTS+radicals

2.2.2 清除DPPH自由基的能力

图8 萃取压力、温度、CO2流速对栀子油清除DPPH自由基能力的影响Fig.8 Effects of extraction pressure, temperature and CO2 flow rate on the DPPH scavenging capacity of gardenia oil

表3 超临界CO2和索氏萃取的栀子油脂肪酸组成(n=3)Table3 Fatty acid composition of gardenia oils extracted supercritical CO2or n-hexane (n=3)%

2,2-二苯基-1-1苦肼基自由基(2,2-diphenyl-1-1picrylhydrazyl，DPPH)分析法是一种筛选自由基清除剂的简便方法。DPPH自由基在有机溶剂中是一种稳定的自由基，呈紫色，在517nm处有强吸收，当有自由基清除剂存在时，DPPH自由基具有的单电子被配对，使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光值变小，且这种颜色的变浅程度与配对电子数成化学计量关系。因此，可通过分光光度法来评价自由基的清除情况。图8显示，栀子油对DPPH自由基具有一定的清除作用，其平均抗氧化能力相当于100g栀子油中含(95.74±0.82)mg α-生育酚。

从图8(A)可以看出，15MPa萃取压力下的栀子油清除DPPH自由基的α-生育酚抗氧化当量远远高于其他压力条件；而其他四种压力条件下的栀子油清除DPPH自由基的α-生育酚抗氧化当量相近，30MPa略低于其他3种压力条件。这可能与不同萃取压力下栀子油中生育酚的含量有关，刘光敏在研究超临界CO2不同条件下石榴籽油的DPPH自由基清除能力时，也得出相同的规律，并已证明了不同萃取压力下石榴籽油的DPPH自由基清除能力与其相应压力下生育酚的含量变化规律基本一致[14]，这为栀子油的进一步研究提供了有力的参考。

从图8(B)可以看出，萃取温度对栀子油清除DPPH自由基的能力影响不大，其α-生育酚抗氧化当量始终在90mg/100g油附近波动。

从图8(C)可以看出，CO2流速对栀子油清除DPPH自由基的α-生育酚抗氧化当量具有一定的影响，但无明显规律性。

2.2.3 清除ABTS自由基的能力

ABTS法最先由Miller等[15]开创，用于测定生物样品的抗氧化能力。ABTS这种水溶性的自由基引发剂为显色剂，其被活性氧氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS＋·，向其中加入被测物质，如果该物质中存在抗氧化成分，则该物质会与ABTS＋·发生反应而使反应体系褪色，然后在ABTS自由基的最大吸光波长(734nm)检测吸光度的变化，即可判断该物质的清除能力。由图9可知，栀子油对ABTS自由基也具有一定的清除作用，其平均抗氧化能力相当于100g栀子油中含(501.69±10.51)μmol水溶性VE。

从图9(A)可以看出，萃取压力对栀子油清除ABTS自由基能力的影响表现为先上升后下降的规律。当压力为22.5MPa时，其水溶性VE抗氧化当量达到最大值，即536.01μmol/100g。当继续升高压力，其清除ABTS自由基的能力下降。原因可能是随着压力的升高，超临界CO2流体的密度增大，对栀子油的溶解度增加，进而萃取得到的功效成分增多。但是压力进一步增大时，可能使部分功效成分的结构遭到破坏，从而使其对ABTS自由基的清除能力下降。

从图9(B)可以看出，随着萃取温度的升高，栀子油清除ABTS自由基的水溶性VE抗氧化当量呈整体上升的趋势，仅在45℃时略有下降，而后逐渐上升。

从图9(C)可以看出，不同CO2流速条件下的栀子油清除ABTS自由基的水溶性VE抗氧化当量的变化趋势同萃取压力对其的影响，也呈现出先升后降的趋势。原因可能是随着流量的增大，浓度差也将增大，浓度差越大越利于提取，但是CO2流速加快，CO2停留时间将会变短，与萃取物的接触时间会变少，所以当流速超过10kg/h时，CO2中溶解的功效成分反而下降。

图9 萃取压力、温度、CO2流速对栀子油清除ABTS自由基能力的影响Fig.9 Effects of extraction pressure, temperature and CO2flow rate on the ABTS+scavenging capacity of gardenia oil

3 结 论

3.1 通过GC对不同萃取条件下栀子全果油中主要脂肪酸组成进行了定性与定量的研究，得出CO2流速对栀子油脂肪酸组成的影响相对略为明显。萃取压力、温度对其影响不显著，但是，在压力和温度分别为30MPa和55℃条件时，萃取所得的不饱和脂肪酸的总含量为最高。

3.2 栀子油对DPPH及ABTS自由基有一定的清除能力，说明栀子油中含有天然的自由基清除剂。通过单因素试验，得出萃取压力为15MPa时栀子油清除DPPH自由基的能力最大，其余压力条件下清除能力较为相近。CO2流速对栀子油清除DPPH自由基能力的影响无明显规律性；萃取压力和CO2流速对清除ABTS自由基的影响均呈现出先升后降的趋势。在30MPa、15kg/h条件下，随着温度的升高，栀子油清除ABTS自由基的能力整体呈上升趋势，而温度对清除DPPH自由基的能力则无明显影响。

[1]倪慧艳, 张朝晖, 傅海珍. 中药栀子的研究与开发概述[J]. 中国中药杂志, 2006, 31(7): 538-541.

[2]YANG Zhi, ZHANG Fang, LIN Xin. Research on the preparation of hydrophobic gardenia blue pigment[J]. Journal of Henan University of Technology Natural Science Edition, 2008, 29(4): 24-27.

[3]LI Wei, YIN Ning. A study on stability of gardenia yellow pigment by macromolecule polymers[J]. China Food Additives, 2008(3): 93-96;92.

[4]蒋益花. 栀子花总黄酮的提取与测定[J]. 浙江农业科学, 2009(4): 839-841.

[5]蒋益花. 大花栀子总黄酮的提取工艺和含量测定[J]. 中药材, 2007, 30(4): 472-475.

[6]余顺火, 李先祥, 马道荣, 等. 超临界CO2流体萃取分离高纯栀子甙的工艺研究[J]. 农产品加工: 学刊, 2008(12): 64-66.

[7]CHEN Quancheng, ZHANG Weiyun, YOUN U, et al. Iridoid glycosides from Gardeniae Fructus for treatment of ankle sprain[J]. Phytochemistry, 2009,70(6):779-784.

[8]回瑞华, 侯冬岩, 刘晓媛, 等. 黑蚂蚁的脂肪酸及抗氧化性能的分析[J]. 分析试验室, 2008, 27(5): 54-57.

[9]邹磊, 汪立君, 程永强, 等. 加工工艺对豆豉抗氧化能力的影响[J].食品科学, 2006, 27(8): 174-177.

[10]GB/T 17376—1998 动植物油脂: 脂肪酸甲酯制备[S].

[11]SHYU Y S, HWANG L S. Antioxidant activity of crude extract of lignan glycosides fromun roasted Burma black sesame meal[J]. Food Research International, 2002, 35(4): 357-365.

[12]ROBERTA R, NICOLETTA P, ANNA P. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay[J]. Free Radical Biology and Medicine, 1999, 26(9/10): 1231-1237.

[13]徐响. 超临界二氧化碳萃取沙棘全果油及主要功效成分分析的研究[D]. 北京: 中国农业大学, 2007.

[14]刘光敏. 超临界二氧化碳萃取石榴籽油及主要功效成分的研究[D].北京: 中国农业大学, 2009.

[15]MILLER N J, RICE-EVANS C. A novel method for measuring antioxidant capacity and its application to monitoring the antioxidant status in premature neonates[J]. Clinical Science, 1993, 84(4): 407-412.

Effect of Supercritical Carbon Dioxide Extraction Conditions on Fatty Acid Composition and Antioxidant Activity of Gardenia Fruit Oil

BAO Ya-ni，DONG Jian-qing，YUAN Fang*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

The fatty acid composition of gardenia fruit oils extracted with supercritical CO2under varying conditions of pressure, temperature and CO2flow rate was determined by gas chromatography. The results showed that there were mainly 5 fatty acids in gardenia fruit oil, namely linoleic acid, oleic acid, palmitic acid, stearic acid and linolenic acid, of which the contents were respectively 44.38%, 24.96%, 24.83%, 2.55% and 1.31% in the oil extracted under 30 MPa, 55 ℃ and CO2 flow rate of 15 kg/h. Each of the three extraction conditions had some effect on the composition of fatty acids in gardenia fruit oil, which showed no statistical significance. It was found that gardenia fruit oil had the ability to scavenge DPPH and ABTS+free radicals, indicating its antioxidant activity. Moreover, extraction pressure, temperature and CO2 flow rate could affect the DPPH and ABTS+free radical scavenging activities of gardenia fruit oil to different extents.

gardenia oil；supercritical CO2；fatty acid composition；antioxidant activity

TS201.1

A

1002-6630(2011)10-0012-06

2010-08-05

教育部高校特色专业建设项目(TS10618)；北京市高校特色专业建设项目；中国农业大学本科生科研训练计划“URP”项目

包亚妮(1989—)，女，本科生，研究方向为食品科学与工程。E-mail：bonie2009@yahoo.cn

*通信作者：袁芳(1967—)，女，副教授，硕士，研究方向为农产品加工与贮藏。E-mail：yuanfang0220@163.com