疯草及毒性成分研究进展

高新磊,韩冰,赵萌莉 ,何江峰,于婷

(1.内蒙古农业大学生命科学学院,内蒙古 呼和浩特010018;2.内蒙古农业大学生态与环境学院,内蒙古 呼和浩特010018)

疯草(locoweed)指含苦马豆素(swainsonine,SW)的豆科多年生草本黄芪属(Astragalus)和棘豆属(Oxytropis)有毒植物[1,2],家畜采食一定量的疯草后,就会表现出中毒症状,严重的导致家畜死亡。疯草引发的家畜中毒症状,国际上将其称为疯草病(locoism)[3]。疯草的分布比较广泛,属于世界性毒草,也是目前对畜牧业危害最大的有毒植物之一。关于家畜疯草中毒最早见于1873年美国加州南部家畜疯草中毒的报道[4],国内的有关报道较晚,在1954年,任继周[5]报道了硬毛棘豆(Oxytropis hirta)和有毒黄芪能引起家畜中毒,这是国内最早的有关家畜疯草中毒的报道,在这以后国内外有关疯草中毒的报道日益增多,人们从此开始关注疯草,并不断对其毒性成分进行研究。1979年,Colegate等[6]首次从灰苦马豆(Swainsona canescens)中分离出吲哚兹定生物碱苦马豆素,并确定其为疯草的主要毒性成分,从此揭开疯草毒性成分研究的新篇章。到目前为止,人们从疯草中分离苦马豆素的工作仍在继续,而对苦马豆素的毒性机理已有了较深入的了解。研究表明,苦马豆素能够可逆抑制溶酶体α-甘露糖甘酶I和抑制高尔基体α-甘露糖苷酶II,前者是导致家畜中毒原因,后者是其具有抗肿瘤作用的原因。疯草主要毒性成分确定之后,人们一直对疯草的产毒机制进行研究。1999年,Braun[7]首次从绢毛棘豆(O.sericea)分离出内生真菌,并确定该菌能够产生苦马豆素,可能与疯草的毒性有关。2004年,McLainRomero等[8]首次培育出了无内生真菌的斑荚黄芪(Astragalus lentiginosus)植株,并确定植株中不含有苦马豆素,由此证明苦马豆素是由疯草内生真菌产生的。在国内,1989年,曹光荣等[9]首次从黄花棘豆(O.ochrantha)中分离出苦马豆素,而对于疯草内生真菌的分离是自2006年Wang等[10]从甘肃棘豆(O.kansuensis)中分离出内生真菌开始,2009年1月,卢萍等[11]从内蒙古小花棘豆(O.glabra)中分离出了内生真菌,同年10月,余永涛等[12]从西藏毛瓣棘豆(O.sericopetala)、冰川棘豆(O.glacialis)、茎直黄芪(A.strictus)中分离出了产苦马豆素内生真菌。

目前,国内外学者针对疯草的研究主要集中在内生真菌的分离鉴定以及内生真菌与苦马豆素之间的关系方面。本研究主要对疯草的分布、危害、防治进行总结,对其毒性成分的研究进展进行综述,并对疯草研究中产生的一些问题进行了讨论,以期望相关研究者们能更深入的去研究疯草,更好的利用疯草。

1 疯草的分布、影响及防治

1.1 疯草的分布情况

在我国,疯草主要分布在西北、西南、华北地区,如内蒙古、宁夏、青海、甘肃、陕西、云南、西藏、新疆等省区。据不完全统计,目前,我国疯草面积已经超过1 100万hm2,约占全国草场面积的2.8%,而且每年都有增加的趋势[13]。我国疯草有45种,其中棘豆属23种、黄芪属22种[14],其中危害较大的疯草包括:棘豆属的黄花棘豆、甘肃棘豆、小花棘豆、毛瓣棘豆和冰川棘豆;黄芪属的茎直黄芪和变异黄芪(A.variabilis)[15]。

在国外,疯草主要分布于北美的美国、加拿大、墨西哥;欧洲的俄罗斯、西班牙和冰岛及北非的摩洛哥和埃及等国,其中以美国西部疯草危害最为严重[16],疯草危害较严重的种类包括:蓝伯氏棘豆(O.lambertii)、绢毛棘豆、密柔毛黄芪(A.mollissimus)、斑荚黄芪等[17]。目前,由于环境物候的改变,许多疯草种群的变化很大,某些疯草的详细分布地区需要重新进行调查。

1.2 疯草的主要危害

疯草的主要危害是引起家畜疯草中毒导致疯草病。疯草中毒是一个慢性过程,普遍以神经调节机能紊乱为主,如走路蹒跚摇晃、缺乏肌肉协调性、进食困难、精神沉郁,头部震颤,反应迟钝,母畜流产,公畜不育[16,18,19]。在病理上的变化更为复杂,但最普遍的组织学变化是神经元、肝肾一些细胞的空泡化变性[16,20]。基于疯草中毒的症状,疯草造成损失的最直接危害是导致家畜中毒死亡及家畜繁殖效率的下降,最终给人们造成重大的经济损失,阻碍了畜牧业的发展。

此外,疯草是草地植被成员之一,已经进化出了对草地环境相对较好的适应性。随着畜牧业的发展,人们对草地自然资源的利用大大增加,对草原利用不当致使某些地区的草场可利用牧草数量下降,结果疯草等有毒植物有机可乘,迅速蔓延,有的草原上已经形成建群种,加之疯草等有毒植物的抗逆性相对较强,会与优良牧草产生激烈的生存竞争,造成优良牧草的产量、质量下降。疯草的蔓延破坏了草地的生态平衡,减少了草地植被的生物多样性,同时,还加速了草场的退化,阻碍了畜牧业的可持续发展。

1.3 疯草的防治

疯草的防治主要包括短期性防治和长期性防治。短期性防治,是指在疯草发生时或是家畜疯草中毒后所采用的即时解决方法,对疯草的防治常能起到立竿见影的效果,但是对疯草防治具有不彻底性。目前,短期性防治所用的方法多为物理和化学方法。物理方法主要包括人工挖除和焚烧等方法,此法在小面积的疯草集中发生地能起到一定的除草效果,但是需要投入大量的人力、物力,同时还可能破坏草地植被。化学方法主要是利用化学药剂除疯草,此法的除草效率较高,且除草速度较快,在疯草大发生时可能起到很好的效果,但仍有缺陷。目前,尚没有针对疯草的特异除草剂,除草剂对其他可食牧草也有毒杀作用,还可能引起环境污染。疯草的种子和根系埋在土壤中,是上述方法所不能根除的,短期性防治过后,疯草仍会再生[21]。

对于已经表现出疯草中毒症状的家畜,可以通过停止家畜进食疯草的方法来缓解,还可以通过一些药物对家畜进行解毒,目前,对于解毒药物的研究已经取得了一些进展。最初,对小花棘豆中毒,一般采取灌酸奶、食醋以及硫代硫酸钠等渗葡萄糖溶液等方法解毒。赵巧娥等[22]用醋糟与黑面混合对小花棘豆中毒山羊解毒;常建军等[23]报道“疯草灵解毒缓释丸”可有效地预防绵羊棘豆中毒,能推迟中毒症状出现的时间,但还不能预防对肝脏、肾脏和肌肉等组织器官的损伤。

疯草的长期性防治,是指从生态学的角度考虑,在不破坏生态系统平衡的前提下,减轻或消除疯草毒性成分对家畜的毒害,从而达到对草地资源的可再生性利用以及畜牧业的可持续性发展的目的,对于家畜多是以预防为主。长期性防治,一般需要经过一段漫长的防治周期。针对疯草,主要采取调整草场结构,控制疯草生长的方法,筛选出对疯草有强竞争性的牧草种,在疯草多发区进行播种,最终降低了疯草种群的数量,降低了家畜中毒的危险性[21,24]。针对家畜,近些年已经发展出了较新的方法(免疫法)来预防家畜中毒。童德文等[25]将苦马豆素与牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)偶联,可以诱导出产生苦马豆素的抗体。在国外,James[26]曾利用Cu、Ca、P、Se、赖氨酸、维生素 E、复合维生素B、吡哆醇和甲状腺制剂饲喂牛羊预防疯草中毒,但未成功。目前,已经分离和培养了苦马豆素降解菌株,有望将其解毒基因转移给家畜的瘤胃微生物,以增加家畜的免疫力[14]。

2 疯草毒性相关研究

2.1 疯草毒性成分研究

对有毒植物毒性成分的研究经历了一段比较曲折的过程,最初,人们认为引起人和家畜中毒的有毒成分是植物的最终代谢物,对植物本身没有任何作用,随着研究的深入才发现,某些有毒植物的毒性成分与植物的次生代谢产物有关。

在国外,棘豆属和黄芪属有毒植物的主要有毒成分可归纳为3类,即脂肪族硝基化合物、硒化合物和生物碱[27],而疯草的主要有毒成分已经被确定为一种生物碱-苦马豆素[28]。

2.1.1 脂肪族硝基化合物毒性机理 目前,已经确定含脂肪族硝基化合物毒素的有毒植物基本上都属于黄芪属有毒植物。Stermitz[29]从矩圆叶黄芪(A.miser var.oblongitotices)中分离出硝基化合物,称为米瑟毒甙(miserotoxin),化学名称为3-硝基-1-丙醇-β-D 吡喃葡萄糖甙(3-nitro-l-propyL-β-D-glucopyransside),在消化道里可被分解为毒性高的3-硝基-1-丙醇(3-nitro-1-propanol,3NPOH),在 1977-1981年,Williams[30]对世界上1 690余种黄芪进行了化学分类研究,发现263种黄芪含有脂肪族硝基化合物。在国内,曹光荣等[31]对黄花棘豆、甘肃棘豆、小花棘豆、毛瓣棘豆等进行分析,确定其中不含脂肪族硝基化合物。

有关中毒机理研究认为,3NPOH在动物体内的代谢物3-硝基-1-丙酸(3-nitro-1-propionic acid,3-NPA)能抑制三羧酸循环中的琥珀酸脱氢酶和延胡索酸酶,阻断三羧酸循环从而引起动物中毒。3-NPA还可以进一步代谢为亚硝酸盐,引起动物的高铁血红蛋白血症。因此,家畜采食植物可引起急性或慢性中毒[27,32]。但是,此毒素引起的中毒症状与疯草中毒不同,所以可以确定脂肪族硝基化合物毒素不可能是疯草毒性成分,同时,含脂肪族硝基化合物毒素的黄芪属有毒植物也不应该归为疯草一类。

我国有17种含脂肪族硝基化合物毒素的黄芪属有毒植物,但未引起大范围的家畜中毒事件,但是在北美的黄芪属植物50%含脂肪族硝基化合物[31,33],可想而知,其家畜中毒几率比较大,Marsh[34]就报道了关于牛、羊四翘黄芪(A.latraperus)的中毒事件。

2.1.2 硒化合物毒性机理 某些黄芪属植物在发育时需要硒,并且具有强的聚硒能力,而关于棘豆属植物的聚硒作用,在国内外未见报道。硒在植物体内以含硫氨基酸的类似物形式存在,因此硒会与体内的含硫化合物发生竞争,从而干扰正常的细胞代谢,有人认为,硒浓度过高超过了机体解毒的最高负荷,最终导致家畜中毒[27,32]。此类毒素引起的中毒症状也不同于疯草中毒,因此,此类毒素也不是疯草毒性成分,聚硒黄芪植物也不应该归为疯草一类。

据调查,我国湖北恩施和陕西柴阳地区属高硒地区,而有毒黄芪中毒一般都发生在缺硒地区,最初,国内学者们进行过相关研究,但是最终确定我国黄芪属植物中毒与硒无关[14]。在北美,很多地区土壤中都富含硒。据报道,美国约有24种聚硒黄芪,家畜食用后都会引起中毒[35]。

2.1.3 生物碱毒性机理 Couch[36]从蓝伯氏棘豆中分离出疯草毒素,可引起猫的疯草病,但未能鉴定其结构。Fraps[37]从密柔毛黄芪中分离出一种有毒成分,取名洛柯因(locoin),洛柯因及其衍生物醋酸盐、酒石酸盐和柠檬酸盐都可引起疯草中毒症状,但当时未能确定其为生物碱。直到1979年,Colegate等[6]首次从灰苦马豆中分离出吲哚兹定生物碱苦马豆素。1982年,Molyneux和James[28]从斑荚黄芪中也分离出苦马豆素,证明苦马豆素为疯草的主要毒性成分。在国内,1989年,曹光荣等[9]首次从黄花棘豆中分离出苦马豆素;2001年,童德文等[38]从甘肃棘豆中分离得到苦马豆素。2002年,谭远友等[39]也分析了西藏冰川棘豆的毒性成分为生物碱。至此,疯草中主要有毒成分为苦马豆素已有充分研究依据。

苦马豆素因最早从灰苦马豆分离出来而得名,其分子式为C8H15O3N,相对分子质量为173,熔点144～145℃,纯品为白色针状晶体,酸解离常数为7.4。苦马豆素属于吲哚兹定生物碱(indolizidine alkaloid),吲哚兹定环的1,2,8位上各带有一个羟基,故被命名为1,2,8-三羟基八氢吲哚兹定(1,2,8-trihydroxyoctahydroindolizidine)。也可被命名为吲哚兹定三醇(8α β-indolizidine-1α,2α,8β-triol)[40],苦马豆素的性质比较稳定,据 Molyneux等[41]报道,在植物体内,保存15年的斑荚黄芪仍含有苦马豆素。

在毒理方面,苦马豆素主要通过抑制溶酶体α-甘露糖甘酶I活性引起细胞功能紊乱,尤其是神经细胞功能紊乱,而使家畜表现出一系列神经症状,即为疯草中毒症状。苦马豆素对溶酶体中α-甘露糖苷酶I产生极大抑制作用,从而造成甘露糖积累,使糖蛋白合成受阻,结果溶酶体内大量低聚糖聚集,导致细胞特别是神经细胞出现空泡变性,使家畜中枢神经系统和实质器官的主质细胞受到损害。苦马豆素对α-甘露糖苷酶I的抑制是可逆的,只有苦马豆素达到一定剂量后,才能表现出中毒症状,家畜停止进食疯草后,细胞修复很快开始,但是可能导致永久性神经功能紊乱[42]。

在药理方面,苦马豆素主要具有抗肿瘤和增加机体免疫力的作用。由于苦马豆素还能抑制高尔基体α-甘露糖苷酶II,此酶用来合成糖蛋白中N-连接的寡糖(N-linked oligosaccharide),而N-连接的寡糖多见于膜或分泌糖蛋白,这些蛋白对恶性肿瘤的增殖和转移十分重要,因此,苦马豆素可能通过抑制高尔基体α-甘露糖苷酶II而最终抑制肿瘤的生长和转移[42,43]。研究表明,苦马豆素有免疫刺激作用,它能增强NK细胞(natural killer cell)和组织特异性巨噬细胞(tissue-specific macrophage)对肿瘤细胞的杀伤作用,诱导细胞因子的合成和分泌;提高IaK-特异性抗原和H LA1类特异性抗原的表达,活化蛋白激酶C,刺激B细胞的增殖[40]。

目前,已经从一些植物和真菌分离提取出了苦马豆素。含苦马豆素的植物有豆科苦马豆属、棘豆属、黄芪属;锦葵科黄花稔(Sida carpini folia);旋花科番薯属(Ipomoea)[13,14]。含苦马豆素的真菌有豆类丝核菌[44-46]、金龟子绿僵菌(Metarrhizium anisopliae)[47]、疯草内生真菌[48]。苦马豆素的提取方法多用索氏提取法或者溶剂冷浸法处理干样[13,49],然后依次经酸水、碱水萃取和硅胶柱层析等逐步纯化,最后对纯化物进行100℃减压油浴升华。超声波协助提取技术提高了苦马豆素的提取效率[13,50]。对苦马豆的定性检测常用薄层色谱法(thin layer chromatography,T LC)[51]和甘露糖苷酶免疫法[52],在此基础上,Gardner等[53]发展了液相色谱-质谱联用技术(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS)定量测定苦马豆素含量的方法,检测限量为0.001%,含量接近这个极限后,还可以用气相色谱-质谱联用技术(gas chromatography-tandem mass spectrometry,GC-MS)进一步检测。目前,国内采用的苦马豆素定量分析方法主要有薄层色谱扫描法、气相色谱法(gas chromatography,GC)和高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)[54]。最近,国内也有人利用核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)技术对苦马豆素进行分析研究[55]。此外,在苦马豆素的人工合成方面也取得了很大进展,早在1984年,美国Yasuda等[56]已经人工合成了苦马豆素,随后Bennett III等[57]人工合成也获得成功,加拿大Toronto化学研究所也有了合成产品;我国周维善[58]对苦马豆素的人工合成也进行了研究。

2.2 疯草产毒机制研究

疯草的毒性成分已经确定为苦马豆素,但是在很长一段时间里,人们对疯草的产毒机制一无所知,直到疯草内生真菌的发现,才初步了解疯草的产毒机制与其内生真菌有关。

植物内生真菌是生活在植物健康组织中的一类微生物,它不引起植物生理病变,与植物是互惠互利的共生关系(如固氮根瘤菌)[59,60]。对其研究最初始于禾草中,19世纪末,人们发现感染内生真菌的一些禾本科植物[如黑麦草(Lolium perenne)]会引起牛、羊等家畜中毒。到 20世纪末,人们才发现豆科疯草中也含内生真菌。Braun[7]在1999年首次从绢毛棘豆分离出内生真菌,并初步鉴定为对链格孢属(Alternaria),2003年从密柔毛黄芪、绢毛棘豆、蓝伯氏棘豆分离出内生真菌,根据分生孢子的形态学鉴定以及内部转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列分析,将其确定为埃里砖格孢属(Embellisia)内生真菌[48,61]。

根据以前对禾草内生真菌的研究发现,内生真菌常存在于植物的叶片、茎、花以及种子之中[62],疯草内生真菌也有同样的特性。疯草内生真菌在培养基上生长能够产生苦马豆素,最初,人们认为苦马豆素是植物的自身次生代谢产物,自从发现疯草内生真菌能够产生苦马豆素后,这种想法也随之转变。2003年,Braun等[48]发现从具有更高苦马豆素含量的植物中分离出来的内生真菌经过培养能产生出更多的苦马豆素。2004年,Gardner等[53]通过对蓝伯氏棘豆16个种群的比较试验发现,低水平的苦马豆素含量与内生真菌的缺失有关,高水平的苦马豆素含量与内生真菌的存在有关。McLainRomero等[63]给试验小鼠喂食疯草内生真菌,结果小鼠表现出疯草中毒症状,还发现在疯草种子中,仅在种皮的糊粉层和薄壁组织层中含有内生真菌,在这之后他们将疯草种子去掉种皮培育出植株,经过PCR测定表明植株中不含有内生真菌,通过LC-MS检测表明植株中不含有或不产生苦马豆素[8]。这就充分的证明了疯草内生真菌是疯草中苦马豆素的主要来源,疯草内生真菌才是导致家畜疯草中毒的元凶。

目前,已经从一些疯草中分离并培养出了内生真菌。在国内,已经从甘肃棘豆和小花棘豆中分离培养出了产苦马豆素的内生真菌,但是对疯草内生真菌的研究还处于起步阶段,相关的研究报道还比较少。在国外,尤其是美国,已经对疯草内生真菌进行了大量相关研究,2003年,Belfon和Creamer[64]通过对疯草内生真菌进行随机扩增多态性DNA标记分析(random amplified polymorphic DNA,RAPD),以及ITS序列分析,结果显示,在棘豆属疯草中分离的埃里砖格孢属内生真菌具有遗传相似性,RAPD条带相同,而且具有几乎一致的核酸序列,而黄芪属疯草内生真菌则显示更高遗传多样性。2005年,Oldrup[65]通过改变一些环境因素,研究了疯草及其内生真菌产生的苦马豆素水平,结果发现在低pH(5.5降至4.5)及中度水分胁迫的条件下,它们的苦马豆素水平会升高,而N、P、K的缺乏、升高温度不影响苦马豆素水平;此外,Oldrup[65]研究还发现,疯草内生真菌还有助于植物抵抗干旱条件。2009年,Pryor等[66]根据内生真菌ITS序列的分析及系统进化树的构建将疯草中的埃里砖格孢属内生真菌重新分类为Undifilim oxytropis内生真菌。

3 疯草研究中存在的问题及建议

3.1 疯草的分类问题

在我国,豆科棘豆属和黄芪属有毒植物的毒性都源于苦马豆素,所以多数国内相关文献中也把所有的豆科棘豆属和黄芪属有毒植物统称为疯草。疯草一词来源于国外,最初指的是豆科棘豆属和黄芪属有毒植物,现在进一步明确含有生物碱苦马豆素的豆科植物为疯草。在国外,黄芪属有毒植物的毒性不都是由生物碱苦马豆素所致,还有一些含脂肪族硝基化合物、硒化合物等毒素,这些毒素所引起的家畜中毒症状与疯草病是不同的,此类黄芪属有毒植物不属于疯草。这样会造成国内外的分类不统一,会给疯草的深入研究带来麻烦,建议对疯草从毒理学角度重新定义,并对其重新分类。

3.2 疯草的研究地域问题

目前,由于地域限制,对疯草研究只能局限在本国某个地区内进行,所得出研究结果可能会有片面性,因为疯草的毒性在很大程度上会受环境因素的制约,例如,本地区的疯草移栽到其他地区,其毒性的强弱是否会改变,尤其在不同国家之间的地理环境差异更为显著,疯草在不同的自然生境下是否会产生不同的生理变化,继续对这些问题的研究会对疯草的改良有很大的帮助。Ralphs等[67]在美国新墨西哥州采集的蓝伯氏棘豆中苦马豆素含量为0.006%,而2002年再次检测却未发现有苦马豆素(或是低于检测下限0.001%);Gardner等[53]检测新墨西哥州、科罗拉多州和犹他州绢毛棘豆苦马豆素含量分别为0.097%,0.062%和0.046%。国外最近研究表明,黄芪属疯草苦马豆素含量普遍高于棘豆属疯草,导致这种差异的原因还不十分清楚。建议扩大对某一种疯草的研究地域,条件允许可以设计在不同国家地区间对某一种疯草进行系统研究。

3.3 疯草的利用前景问题

有些疯草的蛋白含量较高(如黄花棘豆),可以对疯草进行去毒处理或制成饲料草粉,但此法仅限于疯草较集中的地区适用[68]。疯草中所含的苦马豆素还可以用来开发抗肿瘤新药,而且疯草内生真菌能产生苦马豆素,为抗肿瘤药物的生产又开辟了一条新的途径。此外,疯草内生真菌在疯草中,能增加疯草的抗逆性(如抗旱性、抗寒性),其作用机理尚未清楚,有望通过分子生物学技术方法去除疯草内生真菌中的有害基因,使得在不减弱疯草抗逆性及营养性的情况下,得到无毒害疯草,从而达到在根本上改良疯草的目的。目前,国内外对疯草的生理、遗传、生态等方面的相关研究已经取得了一定成果,但是想彻底解决疯草蔓延及牲畜中毒问题,仍然有一条漫长的路要走。

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