0～56日龄舍饲肉用羔羊前胃功能发育研究

郭江鹏,潘建忠,李发弟,2＊ ,郝正里,马友记,张元兴,李海静,马腾

(1.甘肃农业大学动物科学技术学院,甘肃 兰州730070;2.甘肃省饲料工程技术研究中心,甘肃 兰州730070)

瘤胃、网胃和瓣胃构成的前胃是反刍动物特有的消化器官,是其进行微生物消化和物理消化的主要场所[1]。反刍动物前胃的正常发育,除受种别、年龄和体重影响外,还有若干因子影响其功能发育,而饲粮组成及形态、饲养管理模式等因素最为重要[2]。研究表明,犊牛前胃结构和生理功能的发育在很大程度上是采食饲料及其代谢产物影响的结果[3,4];犊牛采食饲料可促进胃部肌肉组织发育,提高瘤胃的蠕动水平及挥发性脂肪酸(volatile fatty acids,VFA)的产生和吸收水平[5];碳水化合物可在瘤胃微生物及其分泌的复合酶和代谢产物的作用下逐步降解成单糖被瘤胃微生物利用,并转化为VFAs(特指各种挥发性脂肪酸,而VFA一般是对挥发性脂肪酸的统称)等物质,为反刍动物新陈代谢过程提供能源[6]。以瘤胃内容物的pH值、VFAs的摩尔组成比例作为研究瘤胃发酵的主要内环境指标,基本上可以反映瘤胃的内部环境状况及饲料在瘤胃内的发酵程度和模式[7,8]。反刍动物瘤胃黏膜不分泌任何酶,其中的酶由微生物分泌,酶的活性、种类与微生物的数量、种类有关[9];瘤胃内容物中微生物酶的活性在一定程度上可以反应微生物的定植与完善程度。因此,以前胃内容物相对重量、内容物pH值及瘤胃VFAs的浓度、摩尔比和微生物蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的活性等作为指标,可较为全面地反映幼年反刍动物过渡为功能性反刍动物的前胃发育过程。

Wardrop和Coombe[10]曾假设认为,放牧羔羊瘤胃生理和功能发育可分为3个阶段:即0～3周龄的非反刍阶段,3～8周龄的过渡阶段和8周龄以上的成年反刍阶段;Poe等[11]证实这一阶段划分同样适合于补饲的舍饲羔羊。但近年来,随着品种改良、饲料生产技术改进和饲养管理模式改善,肉羊生产现状在品种、饲草料及饲养管理等方面都发生了很大变化,国内外近年来虽对绵羊羔羊前胃(尤其是瘤胃)功能的发育有较多研究[12-25],但有关舍饲条件下肉用羔羊前胃功能发育变化的研究尚未见报道,Wardrop和Coombe[10]的假设是否仍适用于目前我国舍饲并早期补饲条件下肉用羔羊的瘤胃生理和功能发育过程,有待进一步验证。本研究选用舍饲甘肃肉用绵羊新品种选育群公羔,研究了0～56日龄羔羊前胃各室内容物相对重量、pH值、瘤胃内容物VFA及主要微生物消化酶等指标的发育变化特点,为较全面了解舍饲条件下肉用羔羊前胃功能的发育变化,进而制定舍饲哺乳肉用羔羊早期饲养管理策略,开发相应补饲技术和产品,实现羔羊早期培育和早期断奶等提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验动物及设计

试验于2009年2-5月进行。从甘肃省永昌肉用种羊场选择健康、生长发育正常的群饲甘肃肉用绵羊新品种选育群公羔(单羔)45只(平均初生重及宰前活重见表1),按组间出生体重相近的原则分为9组。以日龄为单因素进行试验设计,分9个处理,每个处理5个重复,每个重复1只羊;分别于产后0,7,14,21,28,35,42,49,56 d不禁食状态下称活重,而后屠宰、取样,测定瘤胃、网胃和瓣胃的相关指标。

表1 羔羊初生重和宰前活重Table 1 Birthweight and live weight in lambs kg

1.2 羔羊屠宰前的饲养管理

羔羊随同母羊接受全舍饲饲养。出生后0.5～1.0 h内吸吮初乳,之后置羔羊栏中,每日11:30-13:30,16:30-18:30,21:30-次晨8:30放入母羊栏吮吸母乳。于产后7 d开始,投放诱食精料补充料(配方及营养成分见表2)及优质苜蓿干草(铡短至3cm左右,营养成分:干物质 92.50%,粗蛋白质 16.72%,粗脂肪2.16%,粗纤维17.44%,粗灰分10.69%,钙15.57 g/kg DM,磷9.84 g/kg DM),令羔羊自由采食,并供应充足的清洁饮水。

表2 精料补充料组成和营养水平(风干基础)Table 2 Composition and nutrition level of concentrate supplement(air-dry basis)

1.3 屠宰、样品采集与重量、pH 值测定

称羔羊宰前活体重后,颈静脉放血致死。立即打开腹腔,按照《家畜解剖学及组织胚胎学》[27]所述,将胃分为瘤网胃、瓣胃和皱胃,结扎各部位连接处。称取倾出内容物前、后的各胃室重量后,立即测定内容物pH值;而后混匀各胃室内容物、采样;将样品倾入10 mL离心管置液氮中速冻后,转移至-70℃冰箱中保存,以待测定VFAs和瘤胃主要微生物酶。

羔羊初生重、宰前活重、各胃室内容物重量:用电子秤(载量30 kg,感量为0.1 g)称取。全胃内容物重量为瘤网胃、瓣胃和皱胃3部分内容物重量之和。

内容物pH值:用赛多利斯产PB-10型pH计现场测定[28]。

1.4 样品预处理与测定

样品预处理采用杨子江等[28]的方法。测定前低温(4～10℃)解冻样品,在未完全解冻前用分析天平(载量200 g,感量为0.000 1 g)称重,按1∶5(W/V)加入4℃的0.4 mol/L氯化钾溶液冰浴匀浆45 s,4℃、12 000 r/min离心10 min,将上清液分装至5 mL冷冻管中置于-70℃保存备测。

瘤胃内容物VFAs测定采用杨子江等[28]的方法。用安捷伦(Aglient)6890N气相色谱仪测定。色谱柱为19091 N-213。测定条件为:进样口温度220℃,载气(N2)流量 2.0 mL/min,分流比40∶1,进样量0.6 μ L;程序升温:120℃保持3 min,而后升高 10℃/min,180℃保持1 min;FID温度为250℃;氢气 40 mL/min,空气 450 mL/min,尾吹气45 mL/min。

瘤胃内容物蛋白质含量按杨子江[29]对Folin-酚法[30]改进后的方法测定。

瘤胃内容物主要微生物酶活性:蛋白酶活性用李启鹏[19]改进的萃取化学公司法[31]测定,淀粉酶活性用Bernfeld法[31]测定,纤维素酶活性用萃取化学公司法[31]测定。规定在38℃、pH 6.9的条件下,水解酪蛋白每min产生酪氨酸1 μ g为1个蛋白酶活性单位[31]。1个α-淀粉酶单位相当于在38℃和pH 6.9条件下,从可溶性淀粉中释放1 μ mol麦芽糖所需的酶量[31]。1个纤维素酶单位相当于每min释放出0.1 μ mol葡萄糖的还原糖时所需的酶量[31]。

1.5 数据分析

用SPSS 16.0统计分析软件对数据进行单因素方差分析,差异显著时用 Tukey(同质数据)或 Tamhane'2法(不同质数据)作多重比较。试验结果以“Mean±SD”表示,P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 羔羊前胃各室内容物相对重量的日龄变化

羔羊瘤网胃内容物相对重量(%活体重量)在0～42 d呈增高趋势,42～49 d显著增加(P<0.05),28和35 d分别为0 d的24.95和36.55倍;49 d时达到最高,为0 d值的68.89倍(表3)。瓣胃内容物相对重量(%活体重量)为0.02%～0.12%,变化幅度明显较小。羔羊瘤网胃内容物相对重量(%全胃内容物重量)在0～35 d呈线性增加(R2=0.93,P=0.00),其中7～14,21～28,28～35 d显著增加(P<0.05),之后在74.44%～80.73%波动;49 d时达到最高(80.73%),是0 d的15.18倍。瓣胃内容物相对重量(%全胃内容物重量)为0.31%～1.34%,总体随日龄呈下降趋势。

2.2 羔羊前胃各室内容物pH值的日龄变化

0与7 d前胃各室内容物pH值较低,以后随日龄增长稍有升高且较稳定,各日龄间差异均不显著(P>0.05)(表4);其中瘤胃、网胃和瓣胃内容物 pH 值分别为5.30～6.03,5.37～6.42和5.39～6.15。

2.3 羔羊瘤胃内容物挥发性脂肪酸含量的日龄变化

在0 d时全部参试羔羊均未被检出VFAs,7 d时有个别羔羊样被检出;21 d之前,所有羔羊均未被检出异丁酸、异戊酸。随日龄增长,各种VFA浓度均呈上升趋势,其中TVFA(total volatile fatty acids,TVFA)、乙酸、丁酸和戊酸在21～28 d显著(P<0.05)增高或呈增高(P>0.05)的趋势,TVFA、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸浓度在28 d分别为其首次检出日龄(14或21 d)的11.90,8.26,18.31,38.21和5.90倍;之后戊酸浓度相对稳定,TVFA、乙酸、丙酸稳步增高(49 d值除外),丁酸浓度的变化不甚规律(表5)。与42 d相比,49 d的 TVFA、乙酸和丙酸均显著增高,可能突显了该时段受试羔羊的个体特点。

表3 羔羊前胃各室内容物相对重量的日龄变化Table 3 Relative weight of contents in compartments of forestomach in lambs at different age in days %

14 d时乙酸摩尔比和乙酸/丙酸(acetic/propionic,A/P)显著高于其他日龄阶段(P<0.05),而丙酸和丁酸摩尔比显著低于其他日龄阶段(P<0.05)(表6)。在其他日龄阶段,仅28 d丁酸摩尔比显著高于35,42和56 d(P<0.05);各日龄阶段乙酸、丙酸、丁酸和戊酸摩尔比及A/P分别为 0.565～0.676,0.181～0.259,0.115～0.194,0.017～0.028和2.175～3.822。

表4 羔羊前胃各室内容物pH值的日龄变化Table 4 pH value of contents in compartments of forestomach in lambs at different age in days

2.4 羔羊瘤胃内容物微生物酶比活性的日龄变化

0 d时即从2只羔羊瘤胃内容物检出了纤维素酶比活性,自7 d开始所有参试羔羊均被检出纤维素酶比活性;其他2种微生物酶在各日龄阶段参试羔羊中均被检出。瘤胃内容物微生物酶(蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶)比活性存在较大的个体差异,随着日龄的增长,3种微生物酶的比活性均呈增高趋势(表7)。21 d以后的蛋白酶比活性均为7 d的1.5倍以上,以56 d最高(2.66倍);7 d始的各日龄段,α-淀粉酶比活性均为0 d值的3倍以上,49 d为其6.06倍;纤维素酶比活性在14 d有较大的上升,为7 d值的2.81倍,以后日龄增幅放缓,56 d达到7 d的4.00倍。

3 讨论

3.1 日龄对羔羊前胃各室内容物相对重量变化的影响

前人研究表明,当反刍动物采食饲料后,网胃和瘤胃开始迅速增大,羔羊瘤网胃内容物占活重的百分率随年龄增长而递增[2]。本试验结果与前人研究结果相符,羔羊0 d时瘤网胃内容物仅为活体重量的0.15%,而28,35和42 d分别为3.79%,5.56%和7.05%,与韩正康和陈杰[2]的3.9%,4.6%和8.6%甚为相近。所测瘤网胃内容物相对重量(%全胃内容物重量)在7,14,21,28,42和56 d分别为11.09%,25.63%,37.26%,61.54,77.37%和74.44%,与王彩莲等[13]完全放牧不补饲条件下相应日龄的13.77%,24.60%,64.25%,64.26%,69.21%和78.15%相比,仅21 d值明显偏低。舍饲且早期充分补饲精补料与苜蓿干草条件下羔羊能按需要采食,瘤网胃内容物重量能有规律地增长;而全放牧条件下羔羊各时段的牧草觅食量受放牧地可食牧草产量与质量制约,故其瘤网胃内容物重量的增长不甚规律。本试验羔羊瘤网胃内容物在7～14 d显著增长,说明7 d开始补饲的办法对羔羊前胃内容物重量的增加具有明显的促进作用。在28 d时羔羊瘤网胃内容物相对重量(%全胃内容物重量)为 61.54%,35 d时为76.87%,表明在本试验条件下,羔羊在28 d时已具备了实施早期断奶的前胃功能基础,与郭江鹏等[32]通过分析羔羊各胃室重量和容积发育等指标得出的结论

——“在舍饲并早期补饲条件下35 d或提早到28 d进行羔羊早期断奶是可行的”一致。

表5 羔羊瘤胃内容物挥发性脂肪酸浓度的日龄变化Table 5 VFA concentration of rumen contents in lambs at different age in days mmol/L

表7 羔羊瘤胃内容物微生物酶比活性的日龄变化Table 7 Activity of microbic enzymes of rumen contents in lambs at different age in days U/mg蛋白质Protein

本试验中羔羊瓣胃内容物相对重量(%活体重量,%全胃内容物重量)存在波动,没有明显的规律,与王彩莲等[13]的结果相似,可能与瓣胃承担的生理功能及其内容物存量较少有关,个体间差异较大亦是影响因素。

3.2 日龄对羔羊前胃各室内容物pH值及VFA含量变化的影响

瘤胃内容物pH值是反映瘤胃发酵状况的综合指标,受饲粮性质(饲粮结构、物理形式、原料种类及其加工形式)、唾液分泌、瘤胃内VFA及其他有机酸的生成、吸收和排出、饲喂模式等因素的综合影响[33]。本研究前胃各胃室内容物pH值均随日龄增长而稍有上升,是羔羊饲草料采食量逐渐增加、反刍行为逐步出现、唾液分泌量增加及其中和作用增强等因素综合作用的结果。本试验所测前胃各室pH值较王彩莲等[13]所报道(6.03～6.67,6.19～6.83和4.95～6.71)和成年反刍动物均低,是由本试验条件所致;补饲可为羔羊瘤胃发酵提供更多的易发酵碳水化合物,进而导致各胃室pH的降低;较小年龄羔羊(0～56 d)尚不具备成年反刍动物完善的反刍功能,使唾液对胃酸的中和能力降低。按Wardrop和Coombe[10]的假设,放牧羔羊瘤胃生理和功能发育,0～3周龄的非反刍阶段,3～8周龄为过渡阶段,8周龄以上为成年反刍阶段。可看出,这一假设同样也适合于舍饲且进行早期补饲的羔羊。

瘤胃内容物的pH值并不直接影响瘤胃的发育,但它的变化可反映瘤胃VFAs比例的变化,而且直接影响到瘤胃上皮细胞对VFA的吸收和代谢,从而间接影响瘤胃发育[34]。VFA是瘤胃发酵的主要终产物,反映了微生物活性和瘤胃内VFAs的吸收、排出或被中和的状况;饲料类型可显著影响VFA的总量和各种酸的比例,采食精料型饲粮和颗粒饲料,可使VFA水平升高,并提高丙酸的摩尔比[2]。本试验结果与王彩莲等[13]完全放牧不补饲条件下相应日龄羔羊瘤胃液中乙酸、丙酸、丁酸及TVFA含量、A/P存在较大的差别,和朱文涛等[12]4种饲粮条件下(饲粮1:11.91 MJ/kg消化能,20.11%粗蛋白质;饲粮2:11.91 MJ/kg消化能,14.02%粗蛋白质;饲粮3:8.15 MJ/kg消化能,20.09%粗蛋白质;饲粮4:8.15 MJ/kg消化能,14.26%粗蛋白质)相近日龄羔羊上述指标的差异也明显。本试验乙酸和丁酸含量明显高于上述报道,但丙酸含量高于王彩莲等[13](3.559～14.936 mmol/L)而低于朱文涛等[12]的结果(34.3～42.6 mmol/L),进一步证实了饲料类型可显著影响VFA的总量和各种挥发酸比例的结论。此外,本试验测出瘤胃内容物中含有较高的丙酸、丁酸浓度,及郭江鹏等[32]舍饲条件下7 d开始的充足补饲能促使各胃室重量和容积的发育提前7～14 d的结论,均与前人在正常生理范围内,较低的瘤胃pH值不但会引起丙酸、丁酸产量提高,而且能够加强瘤胃上皮对它们的吸收,从而有利于幼龄反刍动物前胃的迅速发育的结论一致。

本试验A/P在2.18～3.82内,表明羔羊瘤胃仍以乙酸发酵类型为主导。研究表明,在足够的还原型辅酶II(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,nicotinamide adeninedinucleotide phosphate-reduced,NADpH)存在的条件下,乙酸和丁酸用于合成脂肪时的理论量热效率较高[2],而丙酸的葡萄糖异生途径是反刍动物体内产生NAD-pH的重要途径。本试验较高的丙酸含量保证了羔羊体内葡萄糖异生前体的较充足供给,为乙酸、丁酸的高效供能提供了足够的NADpH,从而保证了本试验采用的饲养模式有较好的饲养效果。

3.3 日龄对羔羊瘤胃主要微生物酶比活性变化的影响

反刍动物的年龄、饲粮类型及饲养管理模式对瘤胃中各种微生物酶的种类和数量有显著的影响[35,36]。本试验结果表明,纤维素酶比活性的出现存在时间差异,证实了王彩莲等[13]有关研究的报道。本试验中,瘤胃内容物中微生物蛋白酶、α-淀粉酶和纤维素酶比活性的较高活性日龄分别出现在21,7和14 d,与他人研究存在差异。王彩莲等[13]分别出现在14,42和28 d;赵恒波等[15]结果为60 d时3种酶活性较高;kmet等[36]试验表明,羔羊瘤胃内容物蛋白酶和α-淀粉酶活性在20 d时达到最高峰,纤维素酶在30 d时呈峰值;Bomba等[37]研究表明,在常规饲喂方式下,羔羊瘤胃液淀粉酶活性在2～6周明显升高,纤维素酶活性在4周龄明显升高。与前人报道存在差异可能缘于本试验采用的7日龄开始的补饲策略,羔羊在较早的日龄采食到高营养浓度的颗粒型精补料及优质饲草,促进了分泌蛋白酶、淀粉酶及纤维素酶的相关微生物区系的定植和完善,进而提早了淀粉酶和纤维素酶比活性的增高与稳定。

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