光暗交替及全黑暗对水杉种子萌发过程中同工酶的影响

景丹龙，王玉兵，梁宏伟，王静，张德春

（1.三峡大学生物技术研究中心，湖北 宜昌 443002；2.神农架国家级自然保护区管理局生物多样性保护研究实验室，湖北 木鱼 442400）

水杉（Metasequoia glyptostroboides）属杉科水杉属，落叶乔木，素有“活化石”之称，是世界上珍稀的孑遗植物。主要分布在湖北、四川、湖南三省交界的利川、石柱、龙山等局限地区。水杉树形优美，生长快，是亚热带地区平原绿化的优良树种，也是速生用材树种；在古植物学、古气候学、古地理和地质学，以及裸子植物系统发育的研究中均有重要意义[1]。

同工酶是生物体内的结构及理化性质不同而能催化同一反应的酶，广泛应用于生物进化、遗传学、生理学等研究。作为遗传基因的标记植物，它对植物的生理生化及新陈代谢方面的研究具有重要意义。目前，对水杉的研究主要集中在其地理分布、系统演化地位、群落生态学以及遗传多样性等方面[2-3]，由于水杉种子天然发芽率低，种子向幼苗的转型率低，自然更新困难，加上人为破坏等原因，致使野生水杉数量急剧下降而处于濒危状态[4]。笔者针对水杉种子萌发困难的突出问题，通过对水杉种子在光暗交替与全黑暗下萌发过程中的同工酶进行分析，旨在探索水杉种子萌发的分子机理，进而为挽救濒危植物水杉提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

水杉种子采自2010年10月湖北省利川。在水杉种子发芽率试验中，分别取光暗交替（光照12 h/d）和全黑暗条件下，发芽过程中不同萌发时间（1～6 d）的水杉种子，每天取样1次，每次5份，每份0.5 g，液氮处理后，放入-70℃超低温冰箱中保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 酶液制备酶液的提取:分别取-70℃下保存的材料0.5 g，加入PVP 0.1 g，磷酸缓冲液2.5 mL（pH值为7.8，使用时需预冷），冰浴研磨成匀浆，12000 r/min，4℃离心20 min，取上清液，离心3次，即为酶提取液，用于同工酶分析。

1.2.2 电泳和染色同工酶电泳采用不连续垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶制备参照何忠效等[5]的方法。分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为3%，胶厚1.5 mm，每槽加样40 U（酶提取液∶40%甘油∶10%溴酚蓝=30∶10∶1），电极缓冲液为Tris-甘氨酸溶液（pH值为8.3），初始电流强度为20 mA，后增加至30 mA；4℃下，电泳4～5 h后，进行酯酶（EST）、淀粉酶（AMY）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、ATP酶（ATPase）同工酶等5种同工酶的染色。

EST同工酶采用醋酸萘酯-坚牢蓝RR盐染色法[6]；AMY同工酶采用淀粉-醋酸-碘染色法[5]；SOD同工酶参照何忠效等[5]介绍的NBT光还原法；POD同工酶采用醋酸-联苯胺染色方法[5]；ATPase同工酶采用Tris-甘氨酸缓冲-ATP-氯化钙染色法[7]。

2 结果与分析

2.1 水杉种子萌发过程中的酯酶（EST）同工酶酶谱的变化

从图1可知，电泳的负极到正极依次为A1～A13，共13条酶带。其中，A1、A2是各时期的共有酶带。水杉种子在光暗交替条件下萌发时，第3天的EST同工酶酶带数明显增多，第4天达到最多；而黑暗条件下萌发的种子酶带数在第4天才开始增多，第6天达到最多。从整体看，光暗交替条件进行萌发的水杉种子的酶带数和含量要明显优于全黑暗。

图1 水杉种子不同光照条件萌发过程中EST电泳图谱

2.2 水杉种子萌发过程中的过氧化物酶（POD）同工酶酶谱的变化

水杉种子萌发过程中的过氧化物酶（POD）同工酶酶谱变化如图2所示，共有5条酶带，从负极到正极依次为A1～A5，其中A1、A2、A3、A5是各时期的共有酶带。A4在光暗交替条件下第3天出现，接着消失，第6天又重新出现；而A4在全黑暗条件下第4天才出现，消失后第6天又重新出现。由于A4在两种萌发条件下的表达差异明显，所以A4是调控水杉种子萌发的非常重要的酶。

图2 水杉种子不同光照条件萌发过程中POD电泳图谱

2.3 水杉种子萌发过程中的淀粉酶（AMY）同工酶酶谱的变化

水杉种子萌发过程中的淀粉酶（AMY）同工酶酶谱的变化如图3所示，从负极到正极依次为A1-A3，一共3条酶带，其中A1、A3是其各时期的共有酶带，A2在光暗交替条件下第2天出现，而在黑暗条件下第1天出现。但从图中可以看出，水杉种子在光暗交替条件下的AMY同工酶含量高于黑暗条件下，说明光暗交替条件下的水杉种子能在萌发过程中提供更多的能量。

图3 水杉种子不同光照条件萌发过程中AMY电泳图谱

2.4 水杉种子萌发过程中的超氧化物歧化酶（SOD）同工酶酶谱的变化

水杉种子萌发过程中的超氧化物歧化酶（SOD）同工酶酶谱的变化如图4所示，从负极到正极依次为A1～A4，一共4条酶带，其中A1、A4为各时期的共有酶带。水杉种子在光暗交替条件下，A2在第1天出现，A3在第3天出现，而在黑暗条件下，A2在第3天出现，A3在5天出现。这说明光暗交替条件下的水杉种子在清除有害代谢产物方面优于全黑暗条件下。

图4 水杉种子不同光照条件萌发过程中SOD电泳图谱

2.5 水杉种子萌发过程中的ATP酶（ATPase）同工酶酶谱的变化

水杉种子萌发过程中的ATP酶同工酶酶谱的变化如图5所示，一共6条，从负极到正极依次为A1～A6，其中A1、A2、A3、A4为各时期的共有酶带。A5、A6在光暗交替条件下第1天出现，而在全黑暗条件下第5天出现。从整体看，光暗交替条件进行萌发的水杉种子各时期ATPase同工酶含量要明显优于全黑暗所对应的各时期。

图5 水杉种子不同光照条件萌发过程中ATP电泳图谱

3 讨论

光照是植物生长发育过程中不可缺少的环境因子。本试验的结果表明，光暗交替条件下进行萌发的水杉种子的EST、AMY、SOD、POD、ATPase同工酶明显优于全黑暗条件下萌发的水杉种子。种子发芽能力直接影响了植物在森林演替中的地位，一般认为光照强度是先锋植物种类在林下发展的主要限制因子。朱小龙等[8]在研究光照条件对长苞铁杉种子萌发影响时，也发现50%全日照条件下，种子萌发率和幼苗存活率最高。

SOD和POD为细胞氧化还原系统的组成酶，能通过有效地清除细胞内过量的活性氧、自由基，维持胞内活性氧水平的平衡[9]。水杉种子在光暗交替条件下的SOD和POD同工酶含量明显高于全黑暗条件下，说明水杉种子在光暗交替条件下，能够及时清除细胞代谢过程中产生的自由氧基和有害物质，从而减少活性氧对植物体的危害，更利于水杉种子的萌发。AMY和ATPase同工酶能为细胞代谢活动及时提供能量[10-11]，而本试验中光暗交替条件下水杉种子的AMY和ATPase同工酶含量也明显高于全黑暗处理的种子。

从同工酶水平分析可知，光暗交替条件比全黑暗条件更利于水杉种子的萌发。由于自然条件下，水杉种子的空瘪率较高，萌发率较低，因此如何更好的结合其他因素提高水杉种子的萌发率，成为下阶段的研究重点之一。

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