淋病奈瑟菌感染实验室检测技术的进展

廖远泉，廖晖

安徽省泾县医院，宣城 242500

淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae，NG)是淋病的病原菌，有严格的人类寄生性，对人体有很强的适应性和侵袭力。淋病是发展中国家发病率最高的传染病之一[1]，也是目前国内发病率最高的性病[2]。感染 NG 初期，人体常无临床症状，但若得不到及时诊疗可能会导致严重的泌尿生殖道疾病，尤其是女性患者常导致盆腔炎或继发不孕不育。因此，及时准确诊断NG感染已成为治疗淋病的关键。病原菌培养是临床检验诊断NG感染的“金标准”，是目前诊断淋病最可靠的方法。但是，NG耐药性也逐年上升，多重耐药菌的出现使NG培养日趋困难。因此，NG的检验诊断技术研究备受关注。现就NG感染实验室检测技术的研究进展予以综述。

1 NG感染的病原学检验

1.1 分泌物直接涂片染色镜检

常用革兰染色法，亦可采用亚甲蓝染色或瑞氏染色。安邦权等[3]应用瑞氏染色和革兰染色同时检测男性患者尿道分泌物中的 NG，检出率均明显高于传统分离培养法；龚匡隆等[2]对男性患者尿道分泌物标本应用亚甲蓝染色，同时做NG 培养和衣原体抗原检测，提示随着尿道多形核白细胞数升高，NG 感染的危险性不断增高。但是，直接涂片法有其局限性。熊礼宽[4]指出，男性患者分泌物直接涂片革兰染色后镜检，发现细胞内存在革兰阴性双球菌，可结合临床表现作出初步诊断。但男性慢性淋病患者NG常位于细胞外，应加以注意。对女性患者，即使分泌物涂片染色后见革兰阴性双球菌，仍不能诊断，应该继续做培养和鉴定，以排除灰色奈瑟菌、不动杆菌和卡他莫拉菌等。因此，分泌物直接涂片染色镜检用于临床诊断NG 感染价值有限。

1.2 NG的培养与鉴定

1.2.1 NG分离培养基

1.2.1.1 Thayer-Martin培养基 NG营养要求高，在普通血琼脂和营养琼脂上均不易生长，如在培养基中加入血红蛋白、血清或腹水(或鲜牛肉汁)等，NG发育较好。但病原菌常因取材部位其他共生菌的影响而导致初次分离失败。该培养基含有的瑞斯托霉素和多黏菌素B能有效抑制黏膜部位的其他共生菌，经改良后目前已广泛应用。配方主要是在巧克力血琼脂中加入4种选择性抑制剂，其中3～4 μg/ml万古霉素能同时抑制对其敏感的NG，0.3%～30%的目的菌被抑制；但这4种选择性抑制剂还不能有效抑制表皮葡萄球菌、白假丝酵母(白色念珠菌)及某些肠杆菌等，分离结果欠佳。

1.2.1.2 GC-Lect培养基 在改良Thayer-Martin (modified Thayer-Martin，MTM)配方基础上改进，其选择性和分离灵敏度显著提高。陈秀枢等[5]临床检测结果显示，GC-Lect培养基上非目的菌生长率仅9.4%，与MTM培养基相比具有显著意义(P<0.0001)。配方由GC-Ⅱ琼脂基础、牛血红蛋白、Isovitale X(V因子)、1 μg/ml林可霉素、2 μg/ml万古霉素等组成。因为万古霉素对NG最小抑制浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)<2 μg/ml的概率很低，所以提高了NG的临床分离率。国内也研制了卵黄双抗等培养基，但临床应用评价鲜有报道。

1.2.2 NG的常规分离培养及其感染的快速鉴定

将临床采样后的标本即时接种在预温的NG专用培养基上(采样拭子表面与湿润的培养基平面滚动接触呈“Z”字型，再用接种环划线接种)，置于5%的CO2潮湿环境35 ℃培养24～48 h；取可疑菌落涂片、染色、镜检，氧化酶试验和糖发酵试验鉴定为NG，才可确诊为淋病。分离和纯化的细菌培养物亦可应用于化学发光标记的DNA探针杂交试验、凝集试验、单克隆荧光抗体试验等[6]。细菌培养的敏感度和特异度高，目前仍是诊断淋病的最可靠方法，且适合各种临床标本，分离的菌株还可供药敏试验。但NG在人体外抵抗力极弱，对冷、热、干燥和化学消毒剂敏感，临床标本的采集、输送及接种方式等也可能影响检验结果的准确性。而且，NG的营养要求特殊，常规生化反应鉴定不易进行。因此，吕火祥等[7]在MTM培养基中加入葡萄糖、脱纤维绵羊血，使培养基中的营养更加丰富，以诱导NG产生较多量的胞外酶，更易生长，并研制了专用的微量生化反应板以快速鉴定NG。试剂Superoxol为高浓度的H2O2，以检测NG特有的过氧化物歧化酶。NG专用微量生化反应板法操作简便、快速，结果可靠，对分离于口腔及直肠部位的NG鉴定尤具临床意义。

2 NG感染的免疫学检测

2.1 斑点免疫金渗滤试验、生物素-链霉亲和素一步法

董玉娥等[8]在成功制备抗NG单克隆抗体基础上，利用生物素、亲和素的高亲和性和放大作用以及单克隆抗体的特异性，建立了一步法检测NG技术，在细菌培养的同时检测临床拟诊淋病患者。该法与NG培养符合率较好，比常规免疫酶法节省时间，不需特殊设备，且操作简便，可接受大量样本检测，更适合于流行病学调查。检测NG抗原一步法是简易、快速、敏感、特异的免疫学检测方法。

2.2 协同凝集试验

葡萄球菌A蛋白(staphylococal protein A，SPA)具有与人及各种哺乳动物IgG Fc段结合的能力，而不影响抗体Fab段活性。所以，应用抗体致敏SPA的协同凝集试验检测NG简便、实用。

2.3 酶联免疫吸附试验

应用单克隆抗体固相酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测男性急性NG感染者尿道分泌物，结果较满意，但不宜用于女性及口腔(或)直肠部位NG感染者。

3 NG感染的分子生物学检测

3.1 聚合酶链反应

王振勇等[9]应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)和细菌培养分别检测192例生殖道感染者的NG，结果显示两者具有高度的一致性。Bhalla 等[10]的研究也表明，NG培养与PCR检测NG的阳性率一致。

PCR是分子生物学中最常用检测基因的技术手段，也是NG基因诊断中最基本的方法。PCR引物的设计应选择与其相应的靶基因，多采用外膜蛋白抗原基因、隐蔽性质粒DNA或16S RNA基因。目前，实验室检测NG常用的靶基因有porA、opa、Roche COBAS®AMPLICOR和ompⅢ等。Whiley等[11]选择NGporA基因，应用荧光定量PCR扩增其132 bp序列，具有较高的敏感度和特异度。研究发现，opa、ompⅢ基因与其他靶基因位点出现重组的概率很低，可以降低试验的假阳性及假阴性。此外，opa系多拷贝基因，某些菌株多达11个基因位点，引物设计用opa(或多个靶基因联合应用)作为靶基因，可显著提高检测NG的敏感度[12]。亦可选择与其耐药相关的基因设计特异性引物，应用PCR等技术检测NG的耐药性。

3.2 连接酶链反应

连接酶链反应(ligase chain reaction，LCR)是继PCR之后建立起来的快速DNA扩增方法，其特异性高于PCR[13]。Page-Shafer等[14]应用LCR检测NG感染者咽拭子标本，结果显示敏感度为94.7%，特异度为97.8%；其敏感度显著高于细菌培养。彭学标等[15]对170例性病门诊女性就诊者做宫颈拭子NG培养和尿液标本LCR检测，根据“扩大的金标准”确定LCR的检测结果，结果显示LCR的敏感度为94.1%，特异度为100%。收集尿液标本检测方便易行，尤其易为无症状患者接受。LCR操作便捷，适宜做大规模的性病普查，使女性无症状感染者筛查的阳性率显著增加。但其仍需完善的质量控制，应注意避免污染导致的假阳性或抑制物所致的假阴性。

3.3 实时荧光定量PCR及自身淬灭探针定量PCR

Applied Biosystems于1996年研究建立了实时荧光定量PCR技术，实验原理[16]是将荧光能量传递技术应用于常规PCR仪中。即在PCR反应体系中加入荧光基团或荧光染料，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR过程，应用标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。Geraats-Peters等[17]将opa基因作为靶基因，设计了2条荧光探针，并以传统的16S rRNA及COBAS扩增结果作为对照。研究表明，opa基因检测结果较16S rRNA 敏感度高，且未出现假阳性或假阴性。定量PCR快速、准确、可靠，但昂贵的荧光检测仪和荧光标记探针限制其广泛应用。许箐[18]对临床疑似性病患者的检测结果也表明，定量PCR检测NG的阳性率显著高于细菌培养法。

利用构建重组质粒pGEM-11Zf-CPP作为标准品，陈茶等[19]在定量PCR基础上设计了自身淬灭探针定量PCR以检测NG。王箭等[20]对59例疑为NG感染者的检测结果表明，当标准品浓度为102～107拷贝/μl时，自身淬灭定量PCR线性关系良好，其阳性率高于细菌培养的阳性率，两者特异度均为100%。自身淬灭定量PCR实现了PCR扩增、荧光探针杂交及检测一体化，简便、省时。

3.4 膜基因芯片技术

NG和沙眼衣原体是性病的重要病原体。多种病原体常混合感染，且一种病原体的感染对另一种可能具有激活和促进作用。向华国等[21]利用多重PCR结合尼龙膜技术，建立了新的多重PCR-反向线点杂交技术(PCR-based reverse line blot hybridization assay，PCR-RLB)，快速检测NG等病原体感染。分别选择编码NG大亚基核糖体16S rRNA基因和沙眼衣原体隐蔽质粒设计2对特异性引物，并以支原体内转录间隔序列设计1对支原体属通用引物，用生物素标记下游引物，构建三重PCR同时扩增NG等病原体DNA，与固定在膜上的各特异性寡核苷酸探针杂交。对142份性病高危人群标本的检测结果表明，多重PCR可同时扩增NG等病原体DNA，其中NG的PCR产物为414 bp。膜芯片技术无放射性污染；化学发光检测具有检测信号放大作用，敏感度高；尼龙膜结合单链及双链DNA/RNA的能力较硝酸纤维素膜强，可达350～500 μg/cm2，经洗脱处理可多次使用。该技术还可用于无症状人群的性病初筛检验，具有快速、敏感的特点。

3.5 单管多重PCR

鉴于性病常由多种病原体混合感染引起，唐文志等[22]应用单管多重PCR对临床疑似性病感染者标本以双盲法检验，并以荧光定量PCR加细菌培养作为“金标准”，确诊的119例性病阳性(包括40例混合感染)和66例性病阴性病例与单管多重PCR检测结果相符。该技术的敏感度为10-9fg/μl，特异度为100%，符合率为98.3%。

建立在PCR/多重PCR基础上的膜基因芯片技术或单管多重PCR检测性病单一或多重感染，具有简便、快速、准确可靠、经济适用等优点，备受检验医学界的青睐。联合检测多种病原体的临床检验诊断技术已成为病原生物学基因诊断领域新的发展趋势。

4 NG的分型及其耐药性检测

NG的分型方法主要有血清学分型、营养分型和基因分型方法。传统的分型方法根据NG菌毛的有无分为5个型(T1～T5)。目前，分子生物学基因分型技术应用较多，如脉冲场凝胶电泳(pulse field gel electrophoresis, PFGE)、随机扩增多态性DNA分型(random amplified polymorphic DNA，ARPD)、opa分型、por分型、多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)等。多克隆抗体凝集试验分型也简便、实用。随着淋病发病率增加，NG耐药性上升，出现了多重耐药菌并广泛传播，产青霉素酶NG(penicillinase-producingNeisseriagonorrhoeae，PPNG)等耐药菌株的分离鉴定对淋病治疗首选药物的合理应用具有重要意义。

4.1 NG分型

Aydin等[23]应用细菌营养学、血清学和opa基因分型技术对分离于男性尿道炎患者尿道分泌物的56株NG进行分型，结果分别为8、33和55个型别；其中以opa基因分型技术的鉴定指数最高，为0.999。郭光辉等[24]应用重复序列PCR对12株PPNG分型，分为6种，其中A型6株，F型2株，B、C、D、E型各1株，主要流行株为A型。通过分型研究，可了解NG感染的流行特征，为调查和控制其传播途径及传染源提供流行病学依据。

4.2 NG耐药性检测及质粒谱型分析

PPNG对青霉素等抗生素的耐药性，大多由质粒介导，其耐药性可在NG间及其他菌属间传播。侯存军等应用琼脂稀释法测定148株NG对4种抗生素的MIC及其中70株NG的质粒图谱，提示NG对多种抗生素耐药，PPNG阳性率达28.38%～40.20%；头孢曲松和大观霉素是目前治疗NG感染的首选药物；质粒图谱显示地域特殊性[25,26]，但已出现耐大观霉素菌株[27]。按照美国疾病预防控制中心规范，当某病原体对某种抗生素耐药率>5%时，该抗生素就不应作为治疗该病原体感染的首选药物。因此，环丙沙星、青霉素、四环素等不应再作为临床治疗淋病的有效药物。

5 结语

综上所述，淋病的病原学研究必须以NG的分离、培养为基础。新的NG感染检验诊断技术已在临床应用，虽然还有不足或缺陷，但随着分子生物学及相关学科的深入发展、基层医疗条件的不断改善、检验试剂标准和操作规程的进一步规范，其在 NG感染及其他性病的临床诊断中一定具有更广阔的应用前景。

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