泡沫细胞寡核苷酸适配子PM2的特异性研究

林广庆 严鹏科▲ 汪江波 张 慧 段才闻 李世煌

（1.广州医学院附属第三医院药剂科，广东广州510150；2.广西壮族自治区南溪山医院药剂科，广西桂林541002；3.南华大学药物药理研究所，湖南衡阳421001）

泡沫细胞是动脉粥样硬化病变的特征性病理细胞，其中巨噬细胞源性的泡沫细胞是动脉粥样硬化病变中最早出现、最主要的泡沫细胞。Andrew等在Nature Medicine上专文指出，巨噬细胞源性的泡沫细胞有可能成为动脉粥样硬化诊断和治疗的靶点[1]。

SELEX技术是20世纪90年代创立的一种的生物文库技术[2-3]。利用该技术可以从一个大容量的随机寡核苷酸文库中筛选得到与靶物质高特异结合亲和的配基即适配子。它是一个DNA或RNA的寡核苷酸片段，具有靶向靶物质及抑制靶蛋白功能的作用，因此，在基础研究、药物筛选及临床诊断和治疗等方面有着广阔的应用前景。

笔者利用SELEX技术筛选出了巨噬细胞源性泡沫细胞的36个适配子，本研究就其中的40号适配子命名为PM2对动脉粥样硬化病变组织结合的特异性作了进一步研究，现将研究结果进行报道。

1 材料与方法

1.1 实验材料

THP-1细胞株、内皮细胞株为南华大学心血管研究所所保存；血管平滑肌细胞由SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞培养而得；新生牛血清购自杭州四季清生物工程材料有限公司；佛波酯（PMA）为CALBIOCHEM公司产品；低密度脂蛋白（LDL）由北京老年病研究所提供；新西兰白兔：雄性，由湖南农业大学动物科技学院实验动物中心提供，合格证号为scxk（湘）：2003-0003。

1.2 适配子的合成

FITC标记的PM2适配子由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 细胞培养

THP-1细胞株培养：用含有10%新生牛血清的RPMI1640培养基于37℃、5% CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养。每2～3天用直接分瓶的方法传代。

内皮细胞株培养：用含有15%新生牛血清的高糖DMEM培养基于37℃、5% CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养。每2～3天用0.25%胰蛋白酶进行消化传代。

大鼠血管平滑肌细胞培养：在无菌条件下将体重150～200g、4～8周龄的SD大鼠的胸主动脉段取出，刮除内膜迅速撕下中膜内、中层，切成约1mm宽的小条，种植于培养瓶壁，置于37℃恒温箱，待细胞铺满瓶底后进行细胞传代。

1.4 泡沫细胞模型的建立

THP-1细胞培养于6孔板中，实验前用100nmol/L PMA孵育72h，使其诱导分化成巨噬细胞，再用80mg/L oxLDL孵育72h，诱导成泡沫细胞。

1.5 适配子与巨噬细胞源性泡沫细胞结合的特异性鉴定

将培养于6孔板内的约1×106THP-1巨噬细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞及巨噬细胞源性泡沫细胞分别用37℃PBS洗涤3次，分别加入含200pmol FITC标记适配子和1μg酵母tRNA的37℃DPBS液37℃温箱孵育30min,去掉上清液后，再用37℃PBS洗涤3次，荧光显微镜下观察并摄像。

1.6 动脉粥样硬化动物模型的建立

新西兰兔10只，雄性，体重约2.0～2.3kg，随机分为两组，每组各5只。对照组：普通全价营养饲料（粗蛋白20%，粗脂肪13%，碳水化合物60%，灰分1%，维生素混合物1%）；高脂组：在普通全价营养饲料基础上添加1%胆固醇和10%猪油。12周后处死动物，将主动脉自升主动脉至髂总动脉分叉处取出后，福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋后，用Leitz 1560切片机连续切片。

1.7 适配子与动脉粥样硬化病变结合的PCR鉴定

将动脉切片二甲苯常规脱蜡至水，抗原修复后滴入50pmol FITC标记适配子和1μg的酵母tRNA，37℃温箱孵育30min。去离子和PBS液冲洗后，将动脉切片放入6孔板内并加入900μL洗脱液，放入80℃的恒温水箱中15min。将孔内的洗脱液吸出均匀地分装于两个1.5mL的EP管中，加入1/10体积3mol/L NaAC（PH=5.2）和2倍体积预冷的无水乙醇，振荡混匀后放入-80℃冰箱3h或过夜。12000rpm离心30min，经70%乙醇洗涤、空气中干燥后溶于10μL灭菌水中，进行PCR扩增。PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃变性40s，72℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环。最后，72℃再延伸7min。

1.8 适配子与动脉粥样硬化病变结合情况的观察

50pmol FITC标记适配子和1μg 的酵母tRNA滴入经脱蜡和修复抗原处理的动脉切片，37℃温箱孵育30min后，去离子水和PBS液冲洗后荧光显微镜下观察适配子与动脉粥样硬化病变的结合情况。

2 结果

2.1 适配子与巨噬细胞源性泡沫细胞结合的特异性鉴定

在荧光显微镜观察FITC标记的适配子与巨噬细胞源性泡沫细胞结合的特异性，结果发现PM2适配子明显地结合到了巨噬细胞源性泡沫细胞上，泡沫细胞上出现了较强的荧光；与THP-1巨噬细胞存在少量的结合；基本上不结合血管平滑肌细胞和内皮细胞，见图1。

图1 荧光显微镜观察PM2适配子与巨噬细胞源性泡沫细胞结合的特异性（×200）

图2 新西兰兔主动脉HE染色结果（×200）

2.2 动物动脉粥样硬化模型的建立

新西兰兔正常组和模型组分别用普通饲料和高脂饲料饲养12周后，放血处死取出主动脉进行苏丹Ⅳ染色及石蜡包埋、连续切片后HE染色。结果可见动脉粥样硬化病变，说明动物动脉粥样硬化模型的建立成功。见图2。

2.3 适配子与动脉粥样硬化病变结合的PCR鉴定

为了证实PM2适配子与动脉粥样硬化病变结合的特异性，笔者将PM2适配子孵育于动脉粥样硬化兔主动脉病变部位，用洗脱液洗脱后，溶于少量灭菌去离子水中，进行30个循环PCR扩增。通过2.5%的琼脂糖电泳检测发现，PM2适配子均能特异性结合于兔主动脉动脉粥样硬化病变部位；动脉粥样硬化病变的洗脱回收液经PCR扩增都有目的dsDNA片断出现，而正常动脉都无任何dsDNA片断，见图3。

图3 聚合酶链反应观察FITC标记的PM2适配子与动脉粥样硬化病变结合的情况

2.4 适配子与动脉粥样硬化病变结合的特异性观察

将动脉粥样硬化病变切片与PM2适配子结合后，在荧光显微镜下观察发现，动脉粥样硬化病变处有较多的散在的荧光点，中膜平滑肌上除了靠近斑块的部分由少量荧光点外，其他部分几乎没有荧光点，说明动脉粥样硬化病变与适配子特异性结合，见图4。

图4 荧光显微镜观察PM2适配子与动脉粥样硬化病变结合的情况（×100）

3 讨论

单链随机寡核苷酸分子（包括DNA和RNA分子）容易形成各种形状的二级结构和三级结构，如茎环、假节、鼓包、G-四聚体等，基本涵盖所有的空间构像，尤其是RNA分子形成的空间构象更复杂、多样。包括细胞因子、药物、蛋白质、氨基酸、有机染料、完整的组织细胞、甚至金属离子等在内的几乎任何一个靶物质都可以利用 SELEX技术获得与之匹配的寡核苷酸适配子。这些适配子与靶物质结合具有极高的亲和性和特异性，结合的解离常数多在pmol/L～nmol/L之间，明显强于其他物质，甚至强于天然配基[4-5]。而且，其特异性和亲和性不受组织或样品中的非靶蛋白的干扰。寡核苷酸适配子还具有很强的分辨能力，能分辨出靶物质上的细微结构，如一个甲基或羟基的区别。核苷酸、氨基酸的适配子能将它们与突变体、D/L镜象体区分开来。此外，这些适配子基本无毒、无免疫原性、可重复使用、长期保存和室温运输。其中DNA适配子相对于RNA适配子生产成本低、SELEX筛选更简单方便且体内较稳定，不易被降解，更适合体外诊断和体内治疗。

从功能上来说，寡核苷酸适配子能特异性地与靶蛋白结合，并阻断或封闭靶蛋白的功能，对传染病、炎症性疾病等疾病的治疗的研究开辟了新的思路。如通过SELEX筛选获得的HIV-1逆转录酶的适配子[6]、流感病毒凝血酶的适配子[7]分别可以显著抑制HIV病毒和流感病毒复制，降低传染性。寡核苷酸适配子还可以用作靶向剂。由于体积小，有很强的穿透作用且易被血液清除，与放射性同位素、显影剂、药物连接后，靶向病变组织，可用于疾病的体内诊断和治疗。如99mTC锝标记的中性粒细胞弹性蛋白酶的适配子[8]能特异性地在炎症区成像；将适配子修饰后，携带放疗、化疗药物进入肿瘤组织，可以提高肿瘤治疗的特异性。

目前临床确诊动脉粥样硬化的检查如血管内超声（IVUS）、动脉造影价格昂贵，操作技术要求高、对患者有创，因此不容易为患者所接受，更不宜用于动脉粥样硬化高危人群的普查和筛选。尤其是动脉造影，对于早期并不以动脉狭窄为主要表现的动脉粥样硬化很难作出诊断，因而限制了其临床应用。而近年的研究显示[9]，动脉粥样硬化引起的临床事件如急性冠脉综合征的发生往往与动脉粥样硬化引起的动脉狭窄无明显的相关性。在治疗方面，以他汀类药物为代表的抗动脉粥样硬化药物的出现虽然给动脉粥样硬化的治疗带来了希望，但靶向作用不佳，长期服用会带来严重的副作用。因此，早期诊断与靶向治疗仍然是动脉粥样硬化的防治的一个“瓶颈”问题。

巨噬细胞源性泡沫细胞是动脉粥样硬化斑块中最早出现、最主要的标志性细胞，贯穿于整个动脉粥样硬化发生、发展过程，促进细胞内的胆固醇流出对于动脉粥样硬化的转归有着重要意义[10-11]。巨噬细胞源性泡沫细胞的过度凋亡及脂质的增多导致的脂质核心的不断扩大会大大增加动脉粥样硬化斑块的不稳定性。有研究表明[12]大多数急性冠脉综合征患者的动脉斑块中有大量的巨噬细胞源性泡沫细胞凋亡，而抑制巨噬细胞源性泡沫细胞的凋亡、减少细胞内的脂质将有利于稳定斑块，促进动脉粥样硬化的消退。

笔者所在单位以巨噬细胞源性泡沫细胞为靶，利用SELEX技术筛选出寡核苷酸适配子PM2后，结合PCR方法对其与巨噬细胞源性泡沫细胞和动脉粥样硬化病变结合的特异性进行鉴定,结果发现这个适配子特异性结合巨噬细胞源性泡沫细胞；与动脉粥样硬化病变结合也有很强的特异性，说明我们已经成功地获得特异性亲和巨噬细胞源性泡沫细胞的适配子，这也许对于开发针对动脉粥样硬化的早期诊断试剂和靶向治疗药物有着潜在的重要意义。

[1] Li AC，Glass CK.The Macrophage foam cell as a target for herapeteutic Intervention[J]. Nat Med，2002， 8（11）：1235-1242.

[2] Tuerk C，Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment： RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase[J]. Science，1990，249（4968）：505-510.

[3] Ellington AD，Szostak JW. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands[J]. Nature， 1990，346（6287）：818–822.

[4] Soontornworajit B，Wang Y. Nucleic acid aptamers for clinical diagnosis：cell detection and molecular imaging[J]. Anal Bioanal Chem，2011，399（4）：1591-1599.

[5] Clark SL，Remcho VT. Aptamers as analytical reagents[J].Electrophoresis，2002，23（9）：1335-1340.

[6] Joshi P，Prasad VR. Potent inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication by template analog reverse transcriptase inhibitors derived by SELEX（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）[J]. J Viral，2002，76（13）：6545-6557.

[7] Sung Ho Jeon，Basak Kayhan，Tamar Ben-Yedidia，et al. A DNA aptamer prevents influenza infection by blocking the receptor binding region of the viral hemagglutinin[J]. The Journal of Biological Chemisty，2004，276（49）：48410-48419.

[8] Charlton J，Sennello J，Smith D. In vivo imaging of inflammation using an aptamer inhibitor of human neutrophil elastase[J]. Chem Biol,1997，4：809-816.

[9] Folk E，Shah PK. Coronary plaque disruption[J].Circulation，1995，92：657-672.

[10] Igarashi M，Osuga J，Uozaki H，et al. The critical role of neutral cholesterol ester hydrolase 1 in cholesterol removal from human macrophages[J]. Circ Res，2010，107（11）：1387-1395.

[11] Larigauderie G，Furman C. Adipophilin enhance lipid accumulation and prevents lipid efflux from THP -1 Macrophage： potential role in atherogenesis[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24（3）：504 -510.

[12] Gellisen IC，AJ Brown，EL Mander，et al.Sterol efflux is impaired from foam cells selectively enriched with 7-ketocholesterol[J]. Biol Chem，1996，271（30）：17582-17860.