用化学发光免疫法检测有机氯农药DDTs的残留量

张峰,倪慧,张斯

(1.大连海洋大学生命科学与技术学院,辽宁大连116023;2.大连海洋大学辽宁省海洋生物资源恢复与生境修复重点实验室,辽宁大连116023)

用化学发光免疫法检测有机氯农药DDTs的残留量

张峰1,2,倪慧1,张斯1

(1.大连海洋大学生命科学与技术学院,辽宁大连116023;2.大连海洋大学辽宁省海洋生物资源恢复与生境修复重点实验室,辽宁大连116023)

建立了检测有机氯农药DDTs残留的化学发光免疫分析技术(chemiluminescence immunoassay, CLIA),以鲁米诺和过氧化氢作为化学发光底物,测定样品中有机氯农药DDTs残留。结果表明:发光底物液非催化下,5～7 min后发光值较稳定;在发光底物液酶催化下,反应10 min接近峰值;DDTs标准曲线线性范围为0.05～25 ng/mL,标准样品DDTs浓度与发光值呈现很好的线性相关,线性方程为y=-63.806x +13426,R2=0.9945,检测最低限为0.05 ng/mL;回收率为91.4%～107.8%。

有机氯农药;DDTs残留;化学发光免疫分析

目前滴滴涕(DDT)及异构体的残留分析主要采用气相色谱法[1-2]。该方法灵敏度高,但也存在一些不足,如仪器化程度高且价格昂贵,分析速度慢,需专业技术人员,不适合在基层推广。余霞奎等[3]应用气相色谱法对水产品中有机氯农药残留进行检测,结果表明,最低检出限分别为: o,p'-DDT 2.7 μg/kg,p,p'-DDT 4.0 μg/kg,p, p'-DDD 1.6 μg/kg,p,p'-DDE 0.5 μg/kg。化学发光法由于不需要外来光源,避免了瑞利散射和拉曼散射等噪声的影响,大大提高了信噪比[4]。该方法具有灵敏性高、线性范围宽、仪器简单、操作简便等特点,已广泛用于环境、临床、食品和工业分析中。董玉华等[5]应用酶联免疫吸附法分析了海水和贝类中的DDT及代谢物,最低检出限分别为:DDT 25 ng/mL,DDA 1.56 ng/mL,DDD 25 ng/mL,DDE 25 ng/mL。1977年Arakawa等[6]基于放射免疫分析原理,将酶的化学发光和免疫反应结合起来,建立了化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)法。该方法将发光物质或酶标记在抗原或抗体上,免疫反应结束后,加入氧化剂或酶底物而发光,通过测定光强度,根据标准曲线测定待测物的浓度。CLIA的优点是灵敏度高,线性范围宽,标记物的有效期长,无放射性危害,可实现全自动化等。2005年Lin等[7]采用化学发光免疫分析法检测氯霉素,最低检出限为0.046 ng/mL。本试验中,作者初步采用化学发光免疫分析法检测DDTs,以期为检测水产品中DDTs残留量提供更简便的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

试剂鲁米诺(luminuol,BioBasic Inc.)和过氧化氢由上海远大氧化物有限公司生产。美国Abraxis公司提供的DDTs ELISA检测试剂盒中包含本试验所用包被羊抗鼠抗体96孔板、单克隆鼠抗DDTs抗体(此抗体的抗原为o,p'-DDT、p,p'-DDT和p,p'-DDE,因此本试验中检测结果为3种异构体的混合物)、HRP-DDTs标记复合物、DDTs标准品(含有o,p'-DDT、p,p'-DDT和p,p'-DDE,原始浓度为5 μg/mL,介质为甲醇)及标准品稀释液、洗液。其它药品均购自上海生工生物有限公司。

化学发光免疫分析仪由北京亚东亚机械电子技术研究所研制;MK3型酶标仪由上海热点仪器有限公司生产;WZ-A微量振荡器由常州澳华仪器有限公司生产;PHS-3C型数字酸度计购自江苏江分电分析仪器有限公司;100～1 000 μL移液器、40～200 μL移液器、0.5～10 μL移液器均购自上海仪器有限公司;恒温水浴锅、旋转蒸发仪由上海亚荣生化仪器厂生产。

1.2 方法

1.2.1 发光底物液的制备 底物液为鲁米诺和H2O2的混合液(1∶1)[8-10]。鲁米诺和H2O2在没有HRP催化时也能缓慢自行发光,而在光强度测定中造成空白干扰,需分别配制。称取0.0886 g鲁米诺定容于100 mL碳酸盐缓冲液(pH为10)中,得到5×10-3mol/L的原液,避光保存于2～8℃下备用,使用前用0.1 mol/L NaHCO3稀释成5× 10-4mol/L。体积分数为30%的H2O2临用前用0.1 mol/L Tris-HCl(pH为8.5)稀释成5×10-3mol/L备用。

1.2.2 样品处理 取旅顺养殖海参成参体壁,用高速组织捣碎机捣碎,称取20.0 g置于150 mL锥形瓶中,加入高氯酸-冰乙酸(1∶1)40 mL,在瓶口放一小漏斗,置于80℃水浴中,不停地摇动(为防止产生碳粒,开始时要连续摇动几分钟)至内容物全部消化为止。取下锥形瓶,将消化液移入250 mL分液漏斗中,用40 mL温蒸馏水冲洗锥形瓶,将洗液并入分液漏斗中。加40 mL石油醚(重蒸馏,65～75℃)振荡1 min,静止分层后,将水层放入另一40 mL分液漏斗内,加20 mL石油醚并分离,再用20 mL石油醚提取一次。合并提取液,然后加入无水硫酸钠水溶液80 mL,振荡0.5 min,静止分层后,弃去水层。

向提取液中加入浓硫酸(φ(提取液)∶(φ浓硫酸)=10∶1),轻轻振摇,注意打开活塞放气,然后剧烈振摇0.5 min,静止分层,弃去酸层。再按上述操作重复净化2～3次(净化至下层酸呈无色或淡黄色),静止分层后,弃去酸层。加80 mL硫酸钠水溶液,振摇1 min,静止分层,弃去水层。加2～4 g无水硫酸钠于分液漏斗内,轻轻摇动几次,然后将石油醚通过无水硫酸钠柱(筒形漏斗中内装5 cm高的无水硫酸钠),收集溶液用旋转蒸发器浓缩至1 mL,然后用Tris-HCl缓冲液定容至20 mL,用于化学发光酶免疫分析。计算公式为

式中:c为样品中所含DDTs的浓度(ng/g);m为样品质量(g);V为浓缩后体积(mL);y为用化学发光酶免疫分析得到的发光值带入标准曲线方程中计算出的浓度。

1.2.3 发光底物液非催化发光 将发光底物液加入空白孔中,在不同的时间测定其发光值。

1.2.4 发光底物液催化发光 将发光底物液加入含有辣根过氧化物酶的孔中,反应不同时间后测定其发光值。

1.2.5 DDTs标准曲线 试验步骤如下:1)用Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)将DDTs标准品稀释为0、0.05、0.1、0.5、0.625、1.25、2.5、5、10、25 ng/mL 10个浓度梯度。2)每孔加入50 μL单克隆鼠抗DDTs抗体,用单道枪加样,轻轻振荡30 s使孔中溶液混匀,将板装入袋中封口,避免水蒸气和紫外线的照射。在室温(19～25℃)下孵育30 min,然后重复洗板3次,拍板,去掉残留的洗液。3)吸取25 μL不同浓度的DDTs标准溶液加到对应的包被有羊抗鼠抗体微孔中。每个样品设两个对照。4)同时每孔中加入50 μL HRP-DDTs标记复合物,在旋转器上混匀,在室温下孵育30 min。重复洗板3次,拍板,去掉残留的洗液。5)每孔中加入100 μL发光底物液,在化学发光仪上读取发光强度发光值,以相对发光强度(relative light intensity,RLU)的形式表示。

根据结果建立标准曲线,分析试验数据。空白对照,除不加标准品外,其它按以上步骤操作。

1.2.6 加标回收率 取两份相同的样品,其中一份加入定量的待测成分标准物质,按相同方法分析。加标回收率=(加标试样测定值-试样测定值)/加标量×100%。

取实验室养殖幼参若干和成参10头(平均体重为100 g±5 g),去内脏,用高速组织捣碎机捣碎,准确称样品20 g,分别加入5、10、25 ng/mL的DDT标准品25 μL,混匀后按照上述方法测定,同时将未加入DDTs标准品的样品作为空白对照,将分析结果与理论回收值进行对比,计算回收率。

1.2.7 验证化学发光免疫分析法 为了验证本试验中建立的化学发光免疫分析法的可行性,用Abraxis公司DDTs酶联免疫检测试剂盒与本试验中建立的化学发光酶免疫检测DDTs进行对比。应用Abraxis公司提供的DDTs酶联免疫检测试剂盒建立标准曲线,并进行加标回收率测定。

1.3 数据分析

用SPSS 13统计软件进行均数、标准差、组内变异系数的分析,组间显著性方差分析采用F检验。

2 结果

2.1 发光底物液非催化发光和催化发光

从图1可见,发光强度随时间的延长而降低,

在5～7 min内发光值变化差异很小。

图1 发光底物液非催化发光Fig.1 The uncatalyzed chemiluminescence values of the substrate

将底物液分别加入不同浓度(0.625、1.25、2.5、5、10、25 ng/mL)的50 μL辣根过氧化物酶孔中,测定其发光值,结果见图2。从图2可见,发光强度随时间的变化而增强,10 min后接近峰值,之后开始下降。

图2 发光底物液催化发光Fig.2 The catalyzed chemiluminescence values of the substrate

2.2 DDTs标准曲线

从图3可见,标准样品DDTs浓度为0.05～25 ng/mL时呈线性相关,方程为y=-63.806x+ 13426,R2=0.9945。检测的最低限为0.05 ng/mL。

图3 DDTs标准曲线Fig.3 The standard curve of DDTs solution

2.3 组内变异系数及组内、组间的方差分析

从表1可见,不同浓度发光值变异系数均小于2%,表明测定结果的重复性稳定。从表2可见,组内差异不显著,组间存在显著差异。对不同浓度标准品发光值进行多重比较(LSD法)见表3。结果表明,采用化学发光酶免疫法检测DDTs,稳定性较好。

表1 标准样品组内变异系数及方差分析Tab.1 Coefficient of variation and standard deviation of the standard sampleng/mL

表2 不同浓度标准品发光值的方差分析表Tab.2 The analysis of vaiance standard samples with different concentrations

2.4 加标回收率

对幼参的检测结果表明,发光平均值为13 438。将该值带入标准曲线的线性方程,得出其体内未有DDTs残留检出;成参的发光平均值为13 348,依据标准曲线的线性方程得出其浓度为1.22 ng/mL。对加标回收率测定结果见表4,结果显示,回收率为91.4%～107.8%。

表3 不同浓度标准品发光值的多重比较(LSD法)Tab.3 The multiple comparisons of standard sample with different concentrations

表4 DDTs的回收率(n=3)Tab.4 The recovery rate of DDTsng/mL

2.5 化学发光免疫法的验证结果

为了验证本试验中建立的化学发光免疫分析法的准确性,应用Abraxis公司提供的DDTs酶联免疫检测试剂盒建立ELISA法标准曲线,结果见图4。从图4可见,标准样品DDTs浓度为1.25～10 ng/mL时具有很好的线性相关,线性方程为y= -5.5425x+102.85,R2=0.9828。从图5可见,标准样品DDTs浓度为0.625～25 ng/mL时,线性相关性不佳,线性方程为y=～2.3928x+92.255,R2=0.7839。本试验中应用ELISA法建立的标准曲线的检测范围为1.25～10 ng/mL。

图4 ELISA法DDTs(1.25～10 ng/mL)标准曲线Fig.4 The standard curve of DDTs(1.25～10 ng/ mL)by ELISA

图5 ELISA法DDTs(0.625～25 ng/mL)标准曲线Fig.5 The standard curve of DDTs(0.625～25 ng/mL)by ELISA

应用ELISA方法对DDTs加标回收率进行测定,结果表明,当DDTs添加浓度为5、10 ng/mL时,回收率分别为94.6%和108.4%。

3 讨论

本试验中,为了保证采用化学发光免疫法检测样品中DDTs含量的准确性和稳定性,对发光底物液进行了最佳条件优化。发光底物液非催化发光检测结果证实,5～7 min内化学发光相对稳定,相对误差小于3%,能满足检测要求。不同浓度辣根过氧化物酶催化发光底物液时,且反应时间为10 min时,发光值稳定,这与梁雁等[11]的结果一致。

本试验中建立的化学发光免疫法检测DDTs标准曲线在0.05～25 ng/mL范围内呈线性相关,批内变异系数小于2%,组间差异显著。目前国内也将化学发光免疫法用于兽药残留检测。如高彬文等[12]采用化学发光酶联免疫法检测鱼虾中氯霉素的残留量,检测灵敏度达0.01 μg/kg,检测范围为(0.03～23.70)μg/kg,批内变异系数为7.8%,批间变异系数为13%。

为了验证本试验中建立的化学发光免疫法对检测DDTs的可行性,分别用化学发光免疫分析法与酶联免疫分析法对样品实际测定的加标回收率进行分析。结果表明:用化学发光免疫分析法测定样品的回收率为91.4%～107.8%,其标准曲线在0.05～25 ng/mL范围内呈线性相关;用酶联免疫分析法测定的加标回收率为94.6%和108.8%,其标准曲线在0.625～25 ng/mL范围内呈线性相关(R2= 0.7839),在1.25～10 ng/mL时具有很好的线性相关(R2=0.9828)。应用ELISA法检测DDTs的线性范围(1.25～10 ng/mL)小于化学发光免疫检测法检测DDTs的线性范围(0.05～25 ng/mL),表明采用化学发光免疫法检测DDTs时,其灵敏度更高,检测范围更宽。

GB 18421-2001中以海洋贝类(双壳类)为环境监测生物,规定各类具有使用功能的海洋生物中DDT含量(4种异构体的总和)≤0.01 μg/g。欧盟对进口水产品中DDTs最大残留限量标准为0.08 μg/mL,日本为0.02 μg/mL,韩国为0.16 μg/mL。用化学发光酶免疫法检测DDTs残留的检测最低限(0.05 ng/mL)高于各国的最大限量标准。因此,本试验中建立的化学发光免疫法检测DDTs残留技术可以满足当前对DDTs最大残留限量的要求。

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Chemiluminescence immunoassay of organochlorine pesticides DDTs residues

ZHANG Feng1,2,NI Hui1,ZHANG Si1
(1.School of Life Science and Technology,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2.Key Laboratory of Marine Bio-resoursce Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

The chemiluminescence immunoassay(CLIA)method,luminol as CLIA substrate and H2O2as oxidant of luminal,was established for detection of organochlorine pesticides DDTs residues.The results showed that luminescence substrate solution had low and constant luminescence values in 5-7 minutes under uncatalyzed condition, and the peak of the luminescence substrate solution was observed in 10 minutes under catalyzed condition and then the luminescence values began to decrease.The standard curve was found to be linear from 0.05 ng/mL to 25 ng/mL,and linear equation was expressed as y=-63.806x+13426,R2=0.9945,with the minimal detection limit of 0.05 ng/mL,and the recovery varying from 91.4%to 107.8%.

organochlorine pesticides;DDTs residues;chemiluminescence immunoassay

2095-1388(2011)01-0030-05

TS207.5

A

2010-03-15

国家自然科学基金资助项目(3047132)

张峰(1957-),男,教授。E-mail:zhangfeng@dlou.edu.cn