重组腺病毒载体介导外源性XIAP抑制听皮层GABA能神经元凋亡与老年性聋相关性研究进展＊

胡玥 综述 姬长友 陈继川 审校

1 第三军医大学大坪医院野战外科研究所 耳鼻咽喉－头颈外科（重庆 400042）

老年性聋是一类随年龄增长而出现的以双耳进行性高频听力下降为主要表现的慢性退行性疾病。研究表明，大于65岁的老人中，40%以上受老年性聋困扰［1，2］。随着中国逐步进入老龄化社会，老年性聋因严重影响老年人的生活质量而受到社会关注。目前，老年性聋的发病机制并不十分清楚，但研究发现外周听觉系统和听觉中枢功能失调共同参与了老年性聋的发病，其中听觉中枢神经细胞凋亡引起听觉中枢功能障碍是老年性聋患者听力下降、语言理解能力降低的主要原因之一［1，3］。

凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）是一类抑制细胞凋亡的内源性抑制蛋白。Lois Miler实验室成员最早在杆状病毒体内发现一组能抑制被感染细胞发生凋亡的蛋白，并将其命名为IAP蛋白［4］。随后的研究发现，与IAP蛋白具有同源性的蛋白在哺乳动物、昆虫、细菌等许多物种体内普遍表达。迄今为止，研究者们发现人体内IAP家族共包含8个成员，其中X染色体连锁凋亡抑制蛋白 （X－linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）结构最典型、抗细胞凋亡效应最明显、功能最全面，被认为是IAP家族中抑制细胞凋亡能力最强的成员。

明确XIAP对老年性聋听皮层相关细胞的抗凋亡作用，对临床治疗老年性聋、提高老年人生活质量具有重要意义。本文就腺病毒介导外源性XIAP高表达抑制听皮层GABA能神经元凋亡与老年性聋的相关性研究进展作一综述。

1 XIAP的分子结构及作用机制

XIAP基因位于Xq24－25，能表达含497个氨基酸、3个BIR结构域、1个RING结构域、相对分子量约为57kDa的 XIAP蛋白［5］。BIR结构域包含 BIR1、BIR2、BIR3三部分。目前，BIR1区的结构及作用机制尚不清楚，但已明确其能协同BIR2区抑制caspase－3和caspase－7［6］。BIR2区包含3个反向平行β片层、4个α螺旋、3个高保守半胱氨酸和1个组氨酸，每个BIR2区能螯合一个锌原子。在BIR1区的协同作用下，BIR2区能与caspase－3和caspase－7结合并抑制其活性［7］，通过线粒体、内质网和细胞膜三条途径共同抑制细胞凋亡。BIR3区能直接与caspase－9结合形成异源二聚体，使caspsae－9丧失活性，从而终止caspase途径、抑制细胞凋亡［8］。由此可见，BIR结构域是抑制细胞凋亡的重要结合位点。RING结构域是位于XIAP C端的锌指结构域，具有IAP锌指结构的共性，能通过自身泛素化实现自身及结合蛋白的降解，协助其他抑制剂共同抑制细胞凋亡，是XIAP抗凋亡的重要结构。XIAP在人体正常组织中广泛表达，除外周血淋巴细胞外的所有组织均表达。此外，XIAP在许多病理组织甚至肿瘤组织中也有表达，且其表达量与疾病预后密切相关。XIAP分布的广泛性及其抑制细胞凋亡的特殊性使其成为近几年来研究者们研究的热点。

细胞凋亡是一种特殊的死亡方式，是在基因调控下的主动死亡过程，与凋亡过程中酶的参与密切相关。Caspase家族是细胞凋亡过程中的关键元件。目前发现，Caspase家族至少包含14个成员，其中caspase－9是线粒体中caspase途径的起始因子，caspase－3和caspase－7是下游的执行者。XIAP中BIR3结构域能直接与csapase－9结合，使caspase－9保持单体形式，抑制caspase下游级联反应，从而抑制相关活性蛋白的水解并抑制细胞的凋亡和损伤。Caspase－3是caspase级联反应的关键酶，细胞凋亡途径的必经之路［9］。XIAP中BIR2区与caspase－3结合并抑制其激活，与caspase－7结合、抑制其活性并协同抑制caspase－3活性，从而完全终止caspase下游的级联反应。因此，XIAP的BIR结构域能通过抑制caspase途径的起始位点和共同途径两方面抑制细胞凋亡，是XIAP抑制细胞凋亡的重要机制之一。

目前研究表明［10］，XIAP不仅通过caspase级联反应途径抑制细胞凋亡，还可经核因子－κB（nuclear factor－kgene binging，NF－κB）途径抑制细胞的凋亡。XIAP通过泛素化连接酶激活NF－κB经典途径，促进NF－κB抑制剂的凋亡。同时，NF－κB能通过正反馈作用调节XIAP促进其表达上调。XIAP中RING结构域具有泛素化连接酶活性，因此，对其进行抑制即能通过抑制NF－κB途径以达到抑制细胞凋亡的目的。有研究表明［11］，XIAP还能通过抑制c－Jun氨基端激酶（c－Jun N－terminal binases，JNK）的激活抑制其促细胞凋亡作用。

2 XIAP抑制老年性聋听皮层GABA能神经元凋亡效应

2.1 听皮层GABA神经元凋亡是听皮层功能紊乱致老年性聋的重要原因之一

老年性聋在老年人群中普遍存在，配戴助听器虽然解除了部分老年性聋患者的困扰，但其作为听力辅助设备，不能替代中枢神经系统对听觉信号传递、分析和加工的作用。研究发现［12，13］，老年性动物模型听皮层capase－3表达明显升高、神经凋亡速率增加，证明听觉通路神经元的退行性病变及相关细胞的凋亡导致听觉中枢的机能减退是老年性聋的主要病理变化之一。

听皮层神经元可分为兴奋性神经元和抑制性神经元。肖伯奎等［14］检测大鼠听皮层最常见的兴奋性氨基酸类神经递质和抑制性氨基酸神经递质含量时发现，听皮层兴奋性神经递质谷氨酸（Glu）的含量较高，而抑制性神经递质γ－氨基丁酸（GABA）和甘氨酸（Gly）的含量均较低，提示听皮层神经元的反应以兴奋性效应为主，抑制性效应为辅，当听皮层损伤后，因神经元的去抑制作用，导致神经元的兴奋性明显增加。GABA和Gly为大脑皮层最典型的抑制性神经递质，听皮层GABA含量远远大于Gly含量。由此推测，GABA能神经元的凋亡可能是老年性聋的重要机制。Larry［15］研究年轻及老年大鼠听皮层神经元差异时证实，随着年龄的改变，听皮层功能及神经化学递质发生变化，最突出的变化是GABA能神经递质明显减少，进一步证明，听皮层GABA能神经元的凋亡是导致听觉中枢功能障碍的重要原因，是老年性聋患者听力及语言理解能力降低的主要机制之一。

2.2 XIAP在老年性聋听皮层GABA能神经元表达的研究进展

在听力学领域，很多学者在体外研究中已经证实XIAP能有效抑制药物、年龄、创伤等因素引起听觉相关器官细胞凋亡。Wang等［16］将携带有6－Myc标记的人XIAP基因转入2月龄和14月龄C57BL／6J小鼠体内构建转基因动物模型，并以此为实验组动物进行听性脑干反应（ABR）测试、耳蜗毛细胞图分析、Western－blot分析和毛细胞数据分析及计算，结果显示，转基因组小鼠听力损失明显减轻，尤其是高频听力和耳蜗内源性XIAP表达量明显优于非转基因组，而听毛细胞凋亡数目明显减少；实验还发现，转基因动物耳蜗XIAP高表达，但大脑皮层听觉中枢XIAP表达水平没有明显变化，证明内源性XIAP的高表达通过抑制耳蜗毛细胞的凋亡抑制老年性聋的发展。

大量研究致力于内源性XIAP表达与局部听觉器官形态学和功能变化的相关性研究，忽略了外源性XIAP高表达对大脑皮层听觉中枢神经元细胞形态学和功能变化的影响。探索外源性XIAP在听皮层高表达与听力相关疾病发生发展的内在联系，可能是研究老年性聋的新途径，对全面认识、研究和治疗听觉疾病具有重要的作用。李洪波等［17，18］首次对大脑皮层听觉中枢XIAP和caspase－3表达量与老年性聋的相关性进行了研究，实验以15只2月龄（青年组）和15只10月龄（老年组）C57BL／6J小鼠为动物模型，采用ABR、末端转移酶介导的原位缺口末端标记染色法（TUNEL）及免疫组织化学法（SP法）检测实验动物反应阈、听觉皮层神经细胞凋亡量及听觉皮层神经细胞中XIAP、caspase－3表达量。结果显示，老年组小鼠ABR反应阈、凋亡的神经细胞数及caspase－3表达量明显高于2月龄青年组小鼠，但XIAP表达量结果刚好相反，且听觉皮层神经细胞中caspase－3表达量与XIAP表达量及ABR反应阈负相关。实验揭示了听觉皮层XIAP及caspase－3表达水平与老年性聋密切相关，XIAP可能通过caspase－3途径抑制听皮层神经细胞凋亡从而达到改善老年性聋患者语言识别能力的目的。

目前国内外尚无关于XIAP抑制听皮层GABA能神经元凋亡与老年性聋相关性的报道。由此启示，构建能稳定表达外源性XIAP的重组腺病毒载体系统转染老年性聋听觉皮层可能抑制听皮层GABA能神经元凋亡，从而抑制老年性聋的发生、发展，对增强老年性聋患者的听力及对语言的理解能力具有现实意义。明确外源性XIAP抑制听皮层GABA能神经元凋亡作用是研究老年性聋的新方向，为临床寻找老年性聋的治疗方法指明了新道路。

3 腺病毒介导XIAP（Ad－XIAP）在听皮层GABA能神经元高表达与老年性聋相关性的研究展望

第三代腺病毒载体是目前实验室常用载体系统之一，其宿主广泛、滴度较高、安全性好，在基因治疗相关疾病［19］和疫苗载体［20，21］研究领域中备受青睐。随着腺病毒载体系统在实验及临床研究的广泛应用，第三代腺病毒载体系统靶向性不明确、具有免疫原性和细胞毒性等缺点不容忽视。针对这些问题，研究者们［22，23］通过改良腺病毒载体系统局部结构、改变腺病毒转染方法及免疫抑制剂暂时降低宿主免疫力等方法，以提高腺病毒靶向性、降低细胞毒性。

目前关于XIAP在老年性聋听皮层表达的研究刚刚展开，虽然国内外尚无关于重组腺病毒介导XIAP（Ad－XIAP）在听皮层GABA能神经元高表达与老年性聋相关性的研究报道，但构建重组腺病毒载体转染颅脑神经细胞实验早已广泛开展，技术已经非常成熟。Hermann等［24］对C57BL／6J小鼠进行颅内重组腺病毒注射研究基因治疗对大脑中动脉损伤的保护作用；同年该作者［25］再次对大鼠运动感觉皮层立体定向注射重组腺病毒载体，研究神经胶质细胞生长因子对大鼠运动感觉皮层冻伤的治疗作用。尽管尚未见到Ad－XIAP转染听皮层的实验报道，但重组腺病毒转染颅脑神经细胞实验的广泛开展使Ad－XIAP转染听皮层GABA能神经元实验具备了实践的可行性。有研究［26］表明，腺病毒携带XIAP转染大鼠海马部位可通过抑制caspase－3途径保护大鼠CAI海马神经元因短暂性脑缺血引起的死亡；Zadro－Lamoureux等［27］通过构建携带XIAP的腺病毒载体转染实验动物后，发现其能保护视网膜外核层神经细胞产生神经保护作用使其免于凋亡。越来越多的研究者［28～30］开展了重组腺病毒转染皮层神经细胞的实验，从侧面证明重组腺病毒载体携带外源性XIAP（Ad－XIAP）转染大脑听皮层GABA能神经元具有理论可行性。

综上所述，Ad－XIAP转染听皮层神经细胞介导XIAP在听皮层高表达，可通过抑制caspase－3通路有效抑制听皮层GABA能神经元凋亡，从而改善老年性聋患者症状。因此，外源性XIAP在听觉皮层的高表达抑制GABA能神经元凋亡可能是研究老年性聋发病机制的新思路，是临床治疗老年性聋的新方法，对老年性聋的预防和诊治具有启发和引导作用。推测Ad－XIAP对临床治疗老年性聋具有较高的潜在应用价值，必将成为一种新型的治疗老年性聋的途径。

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