单纯疱疹病毒1型US12基因siRNA筛选及其对病毒增殖的影响*

李 深， 任 哲，， 王巧利， 向阳飞， 王一飞△，胡巢凤， 戚仁斌， 陆大祥△， 张庶民， 张佩琢

(暨南大学1生物医药研究开发基地，2医学院病理生理学系，广东广州510632; 3中国药品生物制品检定所，北京100050;4上海吉玛制药技术有限公司，上海201203)

单纯疱疹病毒I型(herpes simplex virus 1，HSV－1)是一种双链DNA病毒，可引起口唇疱疹和疱疹型角膜结膜炎、单纯疱疹病毒性脑炎等许多感染性疾病［1］。病毒感染后可长期潜伏于人体的中枢神经系统，反复发作，给病人造成极大的痛苦与困扰［2］。虽然临床上抗HSV病毒药物种类繁多，但多为核苷类似物，毒副作用大，且存在停药后易反弹、易产生耐药突变株、不能完全抑制和清除潜伏的病毒等缺点。因此，寻找新的抗病毒治疗策略，已成为当今HSV感染后治疗的研究热点［3］。US12基因表达的立即早期蛋白ICP47所针对的是主要组织相容性复合体－I(major histocompatibility complexⅠ，MHC－Ⅰ)抗原呈递过程中决定抗原呈递效率的重要蛋白之一抗原肽转运蛋白(transporter of antigen peptides，TAP)。ICP47可以削弱TAP的肽转运功能，导致抗原递呈细胞表面MHC－I的表达量显著下降，直接干扰了MHC－I途径对细胞毒T细胞的激活，使感染的细胞逃脱了宿主的免疫清除，在病毒感染中起着重要作用［4］。

RNA干扰(RNAi)是一种古老的生物抗病毒机制，是由双链RNA(dsRNA)介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达［5］。RNAi技术已经广泛应用于抗SARS、HIV、HBV病毒等的研究中，RNAi对RNA病毒或逆转录病毒能通过发挥降解病毒基因组及降解靶基因表达的mRNA产生双重抑制作用［6－9］。本实验以HSV－1病毒US12基因为研究对象，筛选有效沉默的siRNA，体外研究其对HSV－1感染的作用，为进一步应用RNAi技术在抗病毒方面的研究奠定基础。

材料和方法

1 材料

1.1 试剂 转染试剂LipofectamineTM2000、Trizol试剂、M－MLV First Strand Kit逆转录酶试剂盒(Invitrogen);SYBR Green PCR Master Mix、KOD－Plus高保真酶(Toyobo);限制性内切酶Pst I和HindⅢ、T4DNA连接酶(TaKaRa);US12克隆及检测引物、GAPDH检测引物(上海生工);其余试剂均为国产或进口。

US12克隆引物:上游引物5'－TATAAGCTTCCATGGTGATGTCGTGGGC－3'，下游引物5'－TACCTGCAGTGTACAACGGGTTACCGGA－3'。US12检测引物:上游引物5'－TGGAAATGGCGGACACCT－3'，下游引物5'－GTTACCGGATTACGGGGACT－3'。

1.2 细胞、病毒、质粒、菌种与培养基 pEGFP－N1质粒、DH5α菌株、HSV－1(F株，ATCC VR733)、Vero细胞(ATCC CCL81)均为本实验室保存;转染培养基为OPTI－MEM无血清培养基(Invitrogen);细胞生长液为含10%胎牛血清(四季青)的DMEM(Gibco)培养基;细胞维持液为含2%胎牛血清的DMEM培养基。

1.3 siRNA设计与合成 从GenBank中获取HSV－1F株US12基因mRNA序列，采用麻省理工学院在线siRNA设计工具搜寻潜在靶序列，并通过NCBI的BLAST Research考察潜在靶序列的二级结构以及同源性，最终得到3对siRNA。另设随机的不靶向任何基因的siN.C作为阴性对照。序列(表1)提交上海吉玛公司合成。siRNA干粉用DEPC水溶解后，得到浓度为40μmol/L的siRNA溶液。

表1 siRNA序列Table 1 .siRNA sequences

2 方法

2.1 pEGFP－N1－US12融合蛋白表达质粒构建HSV－1感染Vero细胞48 h后，Trizol抽提总RNA，逆转录合成cDNA第1链。以cDNA为模板，PCR扩增US12目的基因。反应体系含10×KOD－Plus buffer 5 μL，2 mmol/L dNTP 5 μL，2.5 mmol/L MgSO42.5 μL，10 μmol/L US12克隆引物上、下游引物各1.5 μL，cDNA 1μL，KOD－Plus 1 μL，DMSO 2.5 μL，无菌三蒸水30 μL。电泳检测PCR产物并回收US12片段。US12片段Pst I和HindⅢ双酶切后连接至pEGFP－N1质粒，转化DH5α感受态菌，挑选阳性克隆，重组质粒经菌液PCR和双酶切鉴定后，由Invitrogen公司测序。

2.2 pEGFP－N1－US12与siRNA共转染 Vero细胞以1×106cells/well密度植入6孔板，37℃、5% CO2培养箱内培养至细胞密度达到70% －80%，将pEGFP－N1－US12质粒(4 μg/well)与siRNA(100 pmol/well)用LipofectamineTM2000按照产品说明书混匀并加入转染培养液，同时设siN.C作阴性对照组;37℃、5%CO2培养箱处理4h后，吸弃转染培养液，PBS洗3遍后，加入DMEM生长液。24 h后荧光倒置显微镜(Olympus CKX41)观察融合蛋白表达情况，并用流式细胞仪(Bio－Rad)检测每孔平均荧光强度(MFI)和荧光表达平均阳性细胞率α，计算细胞总荧光强度(TFI)，即TFI=10 000×MFI×α。与单转质粒对照孔细胞相比，定量分析每孔细胞US12－EGFP荧光相对表达强度(relative fluorescence intensity，RFI)，确定siRNA对目的基因表达的抑制效率。

2.3 实时荧光定量PCR检测siRNA对感染细胞内US12 mRNA表达水平的影响 Vero细胞以2×105cells/well的密度植入12孔板，37℃、5%CO2培养箱内培养至细胞密度达到90%，转染siRNA 80 pmol/ well，接种HSV－1病毒(1MOI)，12 h后，Trizol(Invitrogen)抽提总RNA，采用1μg总RNA进行逆转录。以US12检测片段作为标准模板，从1010－103拷贝范围作8个梯度稀释，用于绘制标准曲线。每个样品4个复孔。Choromo 4荧光定量PCR仪进行PCR扩增，使用SYBR Green I检测。

2.4 空斑减数实验 Vero细胞以1.5×105cells/ well的密度植入24孔板，37℃、5%CO2培养箱内培养至细胞密度达到90%，转染siRNA 80 pmol/well，转染方法如上。4 h后，将25－30PFU/well的病毒感染细胞，37℃吸附;1.5 h后，弃病毒液，每孔加入1mL空斑覆盖液(含有0.5%羧甲基纤维素的维持液)。37℃、5%CO2培养箱培养72 h后，吸弃培养基，10%甲醛溶液固定 20 min，1%结晶紫染色30 min，清水漂洗后，晾干，空斑计数。

结果

1 融合表达质粒pEGFP－N1－US12的鉴定

将PCR扩增的US12基因片段连接在pEGFPN1载体上，构建成重组质粒pEGFP－N1－US12，对pEGFP－N1－US12质粒和pEGFP－N1进行双酶切鉴定，双酶切鉴定结果如图1，pEGFP－N1－US12有2条电泳带约在4.7 kD和200 kD处，pEGFP－N1只有4.7 kD处1条条带，这与预期结果一致。测序结果证实目标序列与US12 cDNA序列一致。重组质粒转染Vero细胞，荧光正常表达，说明pEGFP－N1－US12重组质粒构建成功。

2 有效抑制HSV－1 US12基因siRNA筛选

共转染24 h后，荧光倒置显微镜观察(图2)，siRNAS121和siRNAS122明显抑制了荧光的表达; siRNAS123一定程度抑制了荧光的表达;阴性对照siN.C对荧光表达无可见影响。

Figure 1.Restriction enzyme digestion analysis for pEGFP－N1－US12.M:100bp Plus marker;lane 1:US12 fragment;lane 2:pEGFP－N1－US12 digested by Pst I and HindⅢ;lane 3:pEGFP－N1－US12 plasmid; lane 4:pEGFP－N1 digested by Pst I and HindⅢ.图1 pEGFP－N1－US12双酶切鉴定

流式细胞仪检测，计算细胞总荧光强度。与单独转染p－EGFP－N1－US12质粒相比，siN.C阴性对照组无显著差异，见图3;siRNAS121、siRNAS122和siRNAS123实验组与p－EGFP－N1－US12组荧光强度有显著差异(P＜0.01)。siRNAS121、siRNAS122和siRNAS123对US12基因的沉默效率分别为65.46%、66.26%和49.64%。

3 Real－time PCR检测siRNA抑制感染细胞内US12基因的表达

抽提病毒总RNA、逆转录获得cDNA，荧光定量PCR检测siRNA对感染细胞内US12基因表达的影响。US12检测引物与GAPDH检测引物分别对cDNA样品进行PCR扩增，SYBR Green I掺入法实时监测反应的产物量。Opticon Monitor 3软件生成标准曲线。各标准曲线的相关系数R2与斜率k符合理论值范围，线性关系良好，可以作为准确定量的依据。利用Opticon Monitor 3软件计算起始模板量，siRNAS121、siRNAS122和siRNAS123对细胞内US12基因表达抑制率分别为47.11%、67.47%和77.92%，与病毒对照组有显著差异(P＜0.01)，见图4。

4 siRNA对HSV－1在细胞内复制的影响

siRNA转染4 h后，感染病毒72 h后甲醛固定，结晶紫染色后观察空斑大小并计数，结果显示各实验组的空斑形成数与病毒对照均无显著差异(P＞0.05)，见图5。这表明所设计的siRNA对病毒胞间复制没有明显影响。

Figure 2.Specific down－regulation of US12－EGFP expression by different siRNAs(×40).图2 siRNA特异抑制US12－EGFP融合蛋白的表达

Figure 3.The relative expression of US12－EGFP protein after treatment with different siRNAs.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs pEGFP－N1－US12.图3 流式细胞仪检测US12－EGFP融合蛋白相对表达强度

Figure 4.The change of US12 gene expression after different treatment analyzed by real－time PCR.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs V.V:virus control.图4 实时荧光定量PCR分析siRNA对细胞内US12基因表达的影响

Figure 5.Plaques formed by HSV－1 in Vero cells treated with different siRNAs.±s.n=3.V:virus control.图5 siRNA对HSV－1空斑形成数的影响

讨论

HSV－1属α疱疹病毒亚科，为双链DNA病毒，基因组至少编码70多个蛋白，按表达时序可分为α、β和γ 3类;可引起严重疾病如口唇疱疹、疱疹性脑炎、结膜炎、脑膜炎等，出现高热、头痛、呕吐、意识障碍等临床症状、甚至造成死亡。立即早期基因US12编码ICP47蛋白，由88个氨基酸组成。ICP47蛋白结构中没有构成二级结构的元件，且在水溶液中无特有的折叠构象;但是ICP47自身具有膜结合能力，尽管该结合力比TAP存在时要弱约300倍，但是这种膜结合能力的存在很可能有利于ICP47局部浓度的提高，并且折叠成能有效结合TAP的构象，成为ICP47与TAP高亲和力结合的必要条件［11］。ICP47可以与TAP结合，削弱TAP的肽转运功能，导致空载MHC－I分子出现，干扰了MHC－I途径对细胞毒T淋巴细胞的激活，使感染细胞逃脱了宿主的免疫清除，甚至成为病毒在体内的储备库及传播者。

RNA干扰技术已经广泛应用于抗病毒研究中，对许多病毒尤其是RNA病毒或逆转录病毒有较好的抗病毒效果，而对DNA病毒RNA干扰的相关研究较少。本实验室任哲等［10］构建了人 HSV－1 UL40基因融合表达载体pEGFP－N1－UL40，并成功筛选出高效沉默人HSV－1 UL40基因的siRNA。朱钦昌等［12］利用所构建的pEGFP－N1－gD融合表达载体筛选出高效沉默HSV－gD蛋白基因的siRNA并进一步运用于抗HSV－1的研究中。本文在任哲等工作的基础上，针对HSV－1 UL12基因设计siRNA，研究干扰UL12基因对HSV－1病毒的影响。我们的结果显示，所设计的3对靶向UL12基因的siRNAs均能特异性沉默US12 mRNA的表达，但对HSV－1病毒空斑的形成没有明显影响。我们的结果表明，UL12基因与HSV－1病毒的体外增殖可能没有直接的相关性。推测UL12作为HSV－1病毒免疫逃逸的关键基因，其编码的ICP47蛋白主要通过参与体内免疫应答反应而影响病毒增殖。本研究针对特异性沉默UL12基因的siRNAs的成功筛选，为进一步进行干扰UL12基因体内抗病毒研究提供了新的思路和有效的工具。

(致谢:感谢上海吉玛制药技术有限公司对本研究的大力支持。)

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